ВВЕДЕНИЕ

Детская онкология в последние десятилетия достигла значительных успехов в лечении большинства нозологических форм солидных злокачественных новообразований: уровень выживаемости детей с такой патологией, как саркома Юинга, саркомы мягких тканей (не рабдомиосаркомы), нейробластома, сегодня достигает 60–75%, в то время как в 70-е годы ХХ ст. этот показатель не превышал 10–30% [1]. Вместе с тем сохраняет свою актуальность проблема первичной и вторичной (приобретенной) резистентности опухоли к цитостатической терапии. Последняя формируется под влиянием и во время проведения химиотерапии за счет мутации клеток опухоли и селекции их клонов. При этом селективное преимущество относительно неконтролируемой пролиферации получают как первично резистентные клетки, так и приобретшие рефрактерность вследствие определенных генетических изменений, произошедших под влиянием цитостатиков [2]. Повышение эффективности лечения детей с прогностически неблагоприятными, в том числе рефрактерными, формами солидных злокачественных новообразований связывают, прежде всего, с разработкой и внедрением в клиническую практику новых противоопухолевых препаратов и более интенсивных программ цитостатической терапии [3–6].

В связи с этим оценка степени нарушений иммунного гомеостаза приобретает особое значение. В настоящее время проводится интенсивный поиск лабораторных критериев диагностики дисфункции иммунной системы, учитывающий особенности биологии опухолевого роста во взаимосвязи с реакцией организма и ответом на терапию [7].

Целью данного исследования было изучение особенностей активационного фенотипа и функциональной активности лимфоцитов периферической крови (ЛПК) у детей с прогностически неблагоприятными формами злокачественных новообразований мягких тканей (ЗНМТ).

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование включено 20 детей (в возрасте от 7 до 16 лет, средний возраст — 12,5 года) с впервые установленным диагнозом ЗНМТ I–IV стадии, находившихся на лечении в отделении детской онкологии Национального института рака в 2011–2012 гг. (основная группа, табл. 1).

Таблица 1. Распределение детей со ЗНМТ по нозологическим формам

Для сравнения иммунологических показателей использовали данные лабораторно-иммунологического обследования 14 детей в том же возрастном интервале (средний возраст — 11,2 года) без опухолевой патологии (контрольная группа), проходивших обследование в Детской клинической больнице № 5 г. Киева, у которых был исключен острый воспалительный процесс.

Иммунологические исследования включали изучение активационного фенотипа ЛПК с использованием моноклональных антител к HLA-DR и CD95, меченных флуоресцеинизотиоцианатом («Сорбент», Российская Федерация), CD25, меченных фикоэритрином («Becton Dickinson», США), и содержания естественных регуляторных Т-лимфоцитов (Трег, фенотип — CD4⁺25^high) [8]. Учет результатов проводили на проточном цитофлуориметре FACScan («Becton Dickinson», США) с использованием программы «Cell Quest».

Пролиферативную активность лимфоцитов изучали в реакции бласттрансформации (РБТЛ) морфологическим методом с использованием моноклональных антител к CD3 (анти-CD3, «Медбиоспектр», Российская Федерация) в концентрации 3 мкг/мл или фитогемагглютинина (ФГА, «Sigma», Германия) в концентрациях 10 и 20 мкг/мл (соответственно субагглютинирующая и агглютинирующая концентрации [9]). Результаты выражали процентом бласттрансформированных клеток (% БТ).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программ Excel (MS Office 2003, XP) и STATІSTІCA 6,0 (StatSoft Inc., США). Для определения достоверности различий (р) показателей в группах использовали критерий Манна — Уитни. Результаты представляли в виде медианы и значений 10 и 90% квантилей. Различия оценивали как достоверные при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

У детей со ЗНМТ абсолютное количество лимфоцитов в периферической крови снижено (1,56 (0,44; 2,45) х 10⁹/л, против 2,35 (1,98; 3,17) х 10⁹/л в контрольной группе, р<0,05), а их активационный фенотип резко выражен (табл. 2).

Таблица 2. Содержание активированных ЛПК (%) в крови обследованных детей

Примечание: *различие при сравнении с показателем у детей контрольной группы статистически достоверно (р<0,05).

Как видно из данных табл. 2, у детей со ЗНМТ регистрируют существенное увеличение относительного количества клеток, несущих как ранние (CD25), так и поздние (CD95, HLA-DR) маркеры активации. Усиление экспрессии CD25- и HLA-DR-антигенов на ЛПК детей может свидетельствовать в пользу реализации иммунной системой эффекторных функций, в частности генерации опухолеспецифической цитотоксичности (позитивная активация) [10]. С другой стороны, увеличение в циркуляции количества CD95⁺-клеток отражает процесс негативной активации, приводящий к апоптозу лимфоцитов, что, по-видимому, обусловливает развитие лимфоцитопении у этих больных. Такие изменения активационного фенотипа ЛПК могут ассоциироваться с развитием онкопатологии [11].

Кроме того, у детей со ЗНМТ существенно повышена доля активированных Т-хелперов с рецептором к ИЛ-2 (CD4⁺25⁺ ), хотя относительное количество CD4⁺-лимфоцитов в циркуляции не отличается от такового у детей контрольной группы (соответственно 39,5 (26,0; 53,0)% и 36,5 (30,0; 45,0)%, р>0,05). Этот факт заслуживает особого внимания, поскольку известно, что среди популяции CD4⁺25⁺-клеток присутствуют Трег, механизмы иммуносупрессии которых направлены на подавление противоопухолевых иммунных реакций [12–14]. В связи с этим изучено содержание Трег в периферической крови детей (рисунок).

Рисунок. Содержание Трег в крови обследованных детей

Примечание: *различие при сравнении с показателем у детей контрольной группы статистически достоверно (р<0,05).

Как видно из данных (см. рисунок), у детей со ЗНМТ регистрируют высокое содержание Трег в циркуляции, существенно превышающее аналогичный показатель у детей контрольной группы (соответственно 3,7 (1,7; 8,4)% против 2,1 (1,5; 3,9)%, р<0,05). Следовательно, на фоне приобретения лимфоцитами детей со ЗНМТ активационного фенотипа повышается содержание в циркуляции клеток с супрессорными свойствами, что определяет необходимость лабораторной оценки функциональной активности ЛПК.

С этой целью изучено активирующее действие митогена (ФГА) или моноклональных антител к одному из компонентов антиген-распознающего комплекса Т-лимфоцита (СD3-ТкР) на ЛПК в РБТЛ in vitro (табл. 3).

Таблица 3. Пролиферативная активность (% БТ) ЛПК у детей основной и контрольной групп

Примечание: *различие при сравнении с показателем у детей контрольной группы статистически достоверно (р<0,05).

Из данных, представленных в табл. 3, следует, что пролиферативный ответ Т-ЛПК у детей со ЗНМТ при активации клеток по классическому пути, инициированному через CD3-рецептор, не отличается от такового у детей контрольной группы. В то же время их митоген-индуцированная пролиферация, отражающая альтернативный путь активации Т-лимфоцитов в ответ как на субагглютинирующую, так и агглютинирующую дозу ФГА, существенно снижена по сравнению с показателем у детей контрольной группы. Эти данные свидетельствуют о том, что Т-лимфоциты детей с ранними стадиями опухолевого процесса сохраняют способность к формированию антигенспецифических иммунных реакций. Вместе с тем митоген (ФГА), индуцирующий in vitro поликлональную активацию Т-лимфоцитов, в условиях данной модельной системы неэффективен, что, вероятно, обусловлено исходно высокой экспрессией активационных антигенов на ЛПК детей, описанной выше.

Обобщая полученные данные, можно заключить, что изменения в иммунной системе детей с впервые установленным диагнозом ЗНМТ отражают процесс общего реактивного воспаления, лабораторным признаком которого является поликлональная активация лимфоцитов. В таких условиях in vivo для предотвращения развития гипериммунных реакций, потенциально опасных для организма ребенка, включаются механизмы, направленные на подавление противоопухолевого иммунного ответа, опосредованные, в частности, Трег. Такие изменения в иммунной системе детей, по-видимому, носят защитно-приспособительный характер и отражают раннюю реакцию организма на присутствие опухоли.

ВЫВОДЫ

1. Анализ выявленных изменений параметров иммунной системы у детей со ЗНМТ позволяет выделить ряд признаков, важных для диагностики иммунной дисфункции при этих заболеваниях:

• уменьшение общего количества циркулирующих лимфоцитов;
• увеличение относительного количества в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры (CD25⁺, HLA-DR⁺, CD95⁺);
• низкие показатели митоген-индуцированной пролиферации лимфоцитов;
• повышенное содержание Трег в циркуляции.

2. Данные лабораторные критерии могут быть рекомендованы для практического использования в мониторинге состояния иммунной системы детей при проведении основного лечения.

Список использованной литературы

1. Детская онкология / под ред. И.Б. Белогуровой (2002) СПб., 249 с.

2. Pincerton C.R., Plowman C.N. (2005) Cancer chemotherapy and mechanisms of resistance. Pediatric oncology. London, 159–184.

3. Kushner B.H., Cheung N.K., Kramer K. et al. (2001) Topotecan combined with myeloablative doses of thiotepa and carboplatin for neuroblastoma, brain tumors, and other poor-risk solid tumors in children and young adults. Bone Marrow Transplant., 28(6): 551–556.

4. Casanova M., Ferrari A., Sperafico F. et al. (2002) Vinorelbine in previously treated advanced childhood sarcomas. Evidence of activity in rhabdomyosarcoma. Cancer, 94(12): 3263–3268.

5. Saylor R.L., Stine K.C., Sallivan J. et al. (2001) Cyclophosphamide plus topotecan in children with recurrent or refractory solid tumors: a pediatric Oncology Group Phase II study. J. Clin. Oncol., 19(15): 3463–3469.

6. Cosetti M., Wexler L., Colleja E. (2002) Irinotecan for pediatric solid tumors: the Memorial Sloan-Kettering experience. J. Pediatr. Oncol, 24(2): 84–85.

7. Wolchok J.D., Hoos A., O’Day S. et al. (2009) Guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors: immune-related response criteria. Clin. Cancer Res., 15(23): 7412–7420.

8. Пинегин Б.В., Ярилин А.А., Симонова А.В. и др. (2001) Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека. Пособие для врачей-лаборантов. Москва, 55 с.

9. Луцик М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. (1981) Лектины. Львов: Вища школа, 156 с.

10. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. (2008) Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение. Челябинск, 195 с.

11. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. (2009) Руководство по клинической иммунологии: диагностика заболеваний иммунной системы. М.: ГЭОТАР-Медиа, 345 с.

12. Ярилин А.А. (2007) Естественные регуляторные Т-клетки. Рос. мед. журн., 1: 43–48.

13. Козлов В.А., Ярилин А.А., Аметов А.С. и др. (2008) Естественные регуляторные Т-клетки и связанные с ними цитокины при хроническом аутоиммунном тиреоидите. Иммунология, 29(6): 357–361.

14. Widen K., Mozaffari F., Choudhury A., Mellstedt H. (2008) Overcoming immunosuppressive mechanisms. Ann. Oncol., 29(7): 241–247.

Коментарів немає » Додати свій

Leave a comment

Ім’я (required)

Mail (will not be published) (required)

Сайт

CAPTCHA Code