Введение

В 1957 году Isaacs и Lindenman открыли и описали интерферон (ИФН) как фактор, способный индуцировать резистентность клеток к широкому спектру вирусов. ИФН представляют собой ряд близкородственных белков (гликопротеинов) с молекулярной массой от 18 000 до 25 000 Да, характеризующихся антивирусной активностью и являющихся посредниками в межклеточных взаимоотношениях [1].

ИФН обладают противовирусной, антипролиферативной, антигенмодулирующей и иммуномодулирующей ак­тив­ностью.

Противоопухолевая активность ИФН стала известна в начале 70-х годов прошлого столетия, что положило начало исследованиям интерферонотерапии при различных онкологических заболеваниях. Противоопухолевая активность ИФН осуществляется за счет подавления пролиферации опухолевых клеток и неоангиогенеза, стимуляции специфического иммунного ответа и неспецифической иммунной резистентности организма, усиления апоптоза, регулирующего влияния на механизмы дифференцировки злокачественных клеток [2].

Клиническое использование ИФН стало возможным в конце 70-х — начале 80-х годов прошлого века после создания рекомбинантных интерферонов, синтезируемых бактериальными или дрожжевыми клетками, в которые встроен в составе плазмиды или бактериофага ген соответствующего ИФН.

В настоящее время ИФН разделяют на 3 типа в соответствии с их структурными и функциональными особенностями [3]. К интерферонам І типа, называемым вирусными, относятся ИФН-α (ранее называемый лейкоцитарным), ИФН-β (ранее называемый фибробластным), ИФН-δ, ИФН-ε, ИФН-κ, ИФН-τ, ИФН-ω. К интерферонам ІІ типа — ИФН-γ, ранее известный как иммунный, а к интерферонам ІІІ типа — 3 недавно открытых ИФН-λ1–3 (табл. 1).

Таблица 1 Типы интерферонов человека

Примечание: ИФН-δ встречается только у свиней, а ИФН-τ — только у жвачных животных.

Большинство клеток организма, кроме эритроцитов и тромбоцитов, под воздействием различных факторов обладают способностью продуцировать тот или иной вид ИФН. На клеточной поверхности существует 3 типа рецепторов к ИФН: один — к ИФН-γ, другой — к ИФН-λ, третий — ко всем остальным.

Одним из наиболее перспективных для иммунотерапевтического воздействия онкологических заболеваний является меланома кожи. Это связано с высокой иммуногенностью опухоли, что подтверждается высокой частотой спонтанных регрессий меланомы (рис. 1); возникновением паранеопластической депигментации, ассоциированной с продолжительным течением метастатического процесса; развитием витилиго на фоне иммунотерапии; наличием в гистопрепаратах удаленных диспластических невусов и первичной меланомы лимфоидной инфильтрации. Данные иммунологических исследований свидетельствуют о существовании гуморального и клеточного иммунитета против аутологичной меланомы; охарактеризованы опухолевые антигены меланомы на молекулярном уровне [4].

Рис. 1. Спонтанная регрессия меланомы кожи

Клинические исследования интерферонотерапии при генерализованной меланоме кожи были начаты в 1978 году. В результате более 10 исследований по применению ИФН-α объективные ответы были зафиксированы у 16,3% больных с отдаленными метастазами, при этом у 5% наблюдалась полная регрессия опухоли [5, 6].

Эти обнадеживающие результаты положили начало дальнейшим исследованиям, посвященным применению ИФН-α в адъювантном режиме. В 2010 г. опубликован метаанализ 14 рандомизированных исследований, проведенных с 1998 по 2008 гг., по сравнению эффективности ИФН-α с другими методами лечения или наблюдением у 8122 пациентов. Анализ продемонстрировал снижение относительного риска смерти среди больных, получавших ИФН, на 11% (95% ДИ 0,83–0,96; р=0,002), а относительного риска прогрессирования заболевания — на 18% (95% ДИ 0,77–0,87; р<0,001). В нескольких проспективных многоцентровых рандомизированных исследованиях отмечено увеличение 5-летней безрецидивной выживаемости на фоне терапии ИФН-α по сравнению с наблюдением на 9–11%. В то же время влияние на общую выживаемость подтверждено данными только двух исследований и одного метаанализа [7].

Данные о применении ИФН-γ менее многочисленны, чем ИФН-α, однако его высокая иммуномодулирующая активность послужила основанием для клинических исследований.

В 1990-х гг. Eastern Coopertive Group (ECOG) проведено ис­сле­дование, в котором 98 больных с метастатической меланомой получали ИФН-γ в дозе от 0,01 мг/м² до 0,9 мг/м² в ви­де внутривенной 1-часовой инфузии трижды в неделю на протяжении 8 нед. Объек­тивный ответ был отмечен у 4 больных (5%): у 2 — при введении ИФН-γ в дозе 0,01 мг/м², у 1 — в дозе 0,5 мг/м² и еще у 1 — в дозе 0,9 мг/м² [8]. Продолжительность ответа составила от 5 до 58 мес. По данным других исследований, объективный ответ при лечении метастатической меланомы составляет от 4 до 10%, что свидетельствует о невысокой эффективности ИФН-γ при генерализованной форме меланомы кожи.

В 1986–1989 гг. Southwest Oncology Group (SWOG) проведено исследование SWOG 8642 по изучению эффективности ИФН-γ в адъювантном режиме у больных с первично-локализованной меланомой (ПЛМ) кожи высокого риска. В ходе исследования больные после широкого иссечения первичной опухоли рандомизированы в 2 группы: пациенты первой (58 человек) получали ИФН-γ по 0,2 мг/сут подкожно на протяжении 12 мес, второй (66 больных) — подлежали наблюдению. Исследование было досрочно прекращено, так как в исследуемой группе прогрессия заболевания имела место у 34 пациентов при медиане до прогрессирования 9,5 мес, а в контрольной группе — у 25 больных при медиане до прогрессирования 15,3 мес [9]. Дальнейшие исследования по применению ИФН-γ были прекращены, и к данному виду терапии при меланоме кожи относились скептически.

Учитывая возможный синергический эффект, возникающий в результате взаимодействия ИФН-α и ИФН-γ с рецепторами разных классов, вызывает интерес их сочетанное применение. Обнадеживающие результаты получены при внутриочаговом использовании комбинации ИФН-α и γ в лечении пациентов с раком кожи. В пилотном исследовании, в которое вошли 16 больных с рецидивным и местно-распространенным базально-клеточным и плоскоклеточным раком кожи, у 47% наблюдалась полная регрессия опухоли, у 40% — частичная регрессия и у 13% — стабилизация заболевания. Медиана продолжительности объективного ответа составила 38 мес. Среди больных, у которых отмечена полная регрессия опухоли, рецидив заболевания при последующем наблюдении отмечен только в одном случае [10].

Клинические исследования эф­фек­тивности комбинации ИФН-α и ИФН-γ проводились также при почечно-клеточном раке с использованием двух режимов введения цитокинов — одновременного и последовательного. При одновременном применении ИФН двух типов отмечено повышение токсичности без очевидного терапевтического преимущества. В то же время последовательное применение этих препаратов у больных почечно-клеточным раком продемонстрировало более высокий терапевтический и иммуномодулирующий эффект [11].

Учитывая результаты вышеизложенных исследований, мы сочли целесо­образным изучение комбинированной адъювантной интерферонотерапии в последовательном режиме у больных ПЛМ кожи с высоким риском прогрессирования заболевания.

Целью исследования является сравнение эффективности и токсичности комбинированной терапии ИФН-α и ИНФ-γ и монотерапии ИФН-α у больных ПЛМ кожи, а также изучение субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови (ЛПК), их активационного фенотипа и функциональной активности в процессе интерферонотерапии.

Объект и методы исследования

В исследование включен 71 больной с ПЛМ кожи туловища и конечностей (стадия ІВ–ІІС (Т1в–4вN0M0) согласно классификации AJCC 2002 г.), находившийся на лечении в отделении опухолей кожи и мягких тканей Национального института рака в 2008–2009 гг.

До начала лечения для оценки распространенности заболевания пациентам выполняли рентгенографию органов грудной полости, УЗИ органов брюшной полости и регионарных лимфатических узлов.

Лечение начинали с широкого иссечения первичной опухоли кожи (без выполнения биопсии «сторожевого» лимфатического узла). После гистологического подтверждения диагноза меланомы кожи и при толщине опухоли по Breslow более 1 мм и/или ее изъяз­влении, либо IV–V уровне инвазии по Кларку больные рандомизированы в основную и контрольную группы. Характеристика больных по полу, возрасту, локализации первичной опухоли, истадии заболевания представлена в табл. 2.

Таблица 2 Характеристика пациентов

Больным основной группы (33 человека) через 8–10 дней после операции начинали терапию ИФН-γ, который вводили в 1, 3, 5, 7, 9-й дни лечения подкожно в область послеоперационного рубца по 500 тыс. ЕД. С 11-го дня лечения назначался ИФН-α2b подкожно по 3 млн МЕ трижды в неделю в течение12 мес.

Больным контрольной группы (38 человек) через 8–10 дней после операции назначали ИФН-α2b подкожно по 3 млн МЕ трижды в неделю в течение 12 мес.

Изучена токсичность лечения в основной и контрольной группах, а также 2-летняя общая и безрецидивная выживаемость.

Иммунологические исследования проведены у 40 пациентов (20 больных основной группы и 20 контрольной) на 4 этапах лечения: 1-й — перед хирургическим вмешательством; 2-й — через 8–10 дней после хирургического лечения и до начала интерферонотерапии; 3-й — после курса ИФН-γ (основная группа) или после 5 инъекций ИФН-α2b (контрольная группа); 4-й — через 3 мес от начала курса терапии ИФН-α2b.

Изучено содержание основных популяций ЛПК (CD3-, CD4-, CD8-, CD19-, CD16-антигены) и их активационный фенотип (CD95-, CD25-, CD69-, HLA-DR-антигены), естественных регуляторных Т-клеток (Трег, CD4⁺25^high127^low-neg), а также митоген-индуцированную пролиферацию и цитотоксическую активность ЛПК.

Функциональную активность ЛПК изучали в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) и цитотоксическом тесте. РБТЛ выполняли морфологическим методом с использованием фитогемагглютинина (ФГА, «Sigma», Германия) в концентрациях 10 и 20 мкг/мл. Результаты выражали в процентах бласттрансфорованных клеток. Цитотоксическую активность ЛПК определяли методом проточной цитофлуориметрии с использованием клеток-мишеней линии К-562. Результат выражали цитотоксическим индексом (ЦИ) в процентах. Учет результатов цитотоксической активности и фенотипирования ЛПК проводили на проточном цитофлуориметре FACScan («BectonDickinson», США) с использованием программы «CellQuest».

Было обследовано 35 практически здоровых людей (ПЗЛ) в той же возрастной группе.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием программ Excel (MS Office 2003, XP) и STATІSTІCA 6,0 (StatSoft Inc., США). Результаты иммунологических показателей представлены в виде среднего арифметического значения и его стандартной ошибки. Для определения достоверности расхождений (р) показателей независимых групп применены критерий Манна — Уитни, показателей группы в динамике лечения — одновыборочный критерий Уилкоксона. Показатели выживаемости рассчитывали по методу Каплана — Мейера.

Результаты и их обсуждение

В обеих группах имели место типичные для интерферонотерапии осложнения: гриппоподобный синдром (повышение температуры тела, озноб, головная боль, миалгия), местная эритематозная реакция и общая слабость (табл. 3).

Таблица 3 Основные проявления токсичности лечения в основной и контрольной группах

Наиболее частым осложнением в обеих группах была гипертермия, возникающая через несколько часов после введения препарата и в большинстве случаев купирующаяся в течение 2 нед. Однако в основной группе гипертермия и озноб не превышали І степени как во время терапии ИФН-γ, так и при последующем назначении ИФН-α2b, и зафиксированы у 24 больных (72,7%). В контрольной группе гипертермия достигала II–III степени в 100% случаев и требовала применения жаропонижающих средств.

Гематологическая токсичность встречалась в обеих группах у небольшого числа больных в возрасте старше 60 лет, не превышала І–ІІ степени и не требовала прерывания лечения.

Изучение иммунного статуса у больных ПЛМ в процессе интерферонотерапии показало, что у больных контрольной группы после полного курса ИФН-α2b достоверно уменьшается абсолютное количество цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8⁺-лимфоцитов) по сравнению с показателем у ПЗЛ (р<0,05), и снижается их процентное содержание по отношению к исходному уровню и физиологическим значениям (р<0,05). При последовательном применении ИФН-γ и ИФН-α2b содержание этих клеток не претерпевает существенных изменений.

В то же время количество других основных популяций ЛПК существенно не изменяется в процессе лечения как в основной, так и контрольной группах.

Определение абсолютного количества Трег в периферической крови больных ПЛМ показало, что в начале лечения этот показатель не выходит за пределы физиологических значений. В процессе интерферонотерапии в основной группе (последовательное введение ИФН-γ и ИФН-α2b) наблюдается тенденция к увеличению абсолютного количества Трег, а в контрольной (только ИФН-α2b) напротив — к снижению (рис. 2).

Рис. 2. Содержание регуляторных Т-клеток в периферической крови больных ПЛМ в динамике интерферонотерапии

Анализ экспрессии маркеров активации на циркулирующих лимфоцитах показал, что до лечения у больных обеих исследуемых групп достоверно увеличено относительное количество клеток, экспрессирующих HLA-DR. Курс ИФН-α2b, проведенный больным контрольной группы (3–4 этапы), не влияет на содержание HLA-DR⁺-лимфоцитов. У больных основной группы после курса ИФН-γ количество HLA-DR⁺-лимфоцитов снижается до нормальных значений, однако после 3 мес терапии ИФН-α2b возвращается к исходному уровню. Относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих CD69-, CD25- и CD95-антигены, до лечения практически не отличается от нормы. Повышение экспрессии маркера CD69 на лимфоцитах происходит у больных контрольной группы после 5 инъекций ИФН-α2b, а у больных основной группы — после 3-месячного курса ИФН-α2b. Содержание CD25⁺-лимфоцитов не изменяется в процессе интерферонотерапии у больных основной группы, в то время как у больных контрольной группы наблюдается достоверное увеличение этого показателя на 4-ом этапе обследования. Количество лимфоцитов, экспрессирующих CD95, у больных контрольной группы превышает физиологические значения после 5 инъекций ИФН-α2b и сохраняется на высоком уровне до конца наблюдения. Напротив, у больных основной группы относительное количество CD95⁺-лимфоцитов не изменяется в процессе интерферонотерапии, а на 3–4-ом этапе существенно снижено по сравнению с показателем у больных контрольной группы (рис. 3).

Рис. 3. Содержание активированных лимфоцитов в периферической крови больных ПЛМ в динамике интерферонотерапии. Примечания: • — различия при сравнении с показателем ПЗЛ статистически достоверны (р<0,05); * — различия при сравнении с показателем у больных основной группы на соответствующем этапе обследования статистически достоверны (р<0,05).

У больных ПЛМ до начала лечения регистрируется сниженная (р>0,05) цитотоксическая активность лимфоцитов. Применение обеих схем интерферонотерапии способствует улучшению этого показателя как в контрольной, так и основной группах (рис. 4).

Рис. 4. Влияние интерферонотерапии на цитотоксическую активность ЛПК

До лечения у больных контрольной и основной групп пролиферативный ответ лимфоцитов на ФГА в концентрации 20 мкг/мл не отличается от нормы, в тоже время регистрируется достоверное снижение ответа на ФГА в концентрации 10 мкг/мл. Последовательное применение ИФН-γ в сочетании с ИФН-α2b у больных ПЛМ приводит к усилению пролиферации лимфоцитов в ответ на ФГА (в концентрациях 10 и 20 мкг/мл) по сравнению с таким до лечения и показателем у больных контрольной группы на 4-ом этапе обследования. У больных контрольной группы через 3 мес от начала курса ИФН-α2b (4-й этап) наблюдается существенное снижение ответа лимфоцитов на ФГА в концентрации 10 мкг/мл (рис. 5).

Рис. 5. Влияние интерферонотерапии на пролиферативную активность ЛПК. Примечания: а — концентрация ФГА 10 мкг/мл, б — концентрация ФГА 20 мкг/мл; • — различия при сравнении с показателем ПЗЛ статистически достоверны (р<0,05);  ∆ — различия при сравнении с показателем у больных меланомой на 1-ом этапе обследования статистически достоверны (р<0,05); * — различия при сравнении с показателем у больных контро­льной группы на соответствующем этапе обследования статистически достоверны (р<0,05)

В обеих группах изучалась 2-летняя общая и безрецидивная выживаемость (рис. 6). Безрецидивная выживаемость больных основной группы составила 84,8±6,2% , контрольной — 78,9%±6,6%. Общая выживаемость в основной группе составила 93,9±4,1%, в контрольной — 86,8±5,4%. Различия между этими показателями статистически не достоверны (р>0,05).

Рис. 6. Общая и безрецидивная 2-летняя выживаемость

Выводы

1. Обе схемы интерферонотерапии относительно хорошо переносятся пациентами. Наиболее частым проявлением токсичности является гипертермия, которая носит кратковременный характер, хорошо купируется приемом жаропонижающих средств и не требует прерывания лечения.

2. Представленные схемы интерферонотерапии по-разному влияют на иммунологические показатели у больных ПЛМ. Последовательное применение ИФН-γ и ИФН-α2b в адъювантном режиме у больных ПЛМ не оказывает существенного влияния на экспрессию активационных антигенов на лимфоцитах, в тоже время повышает их пролиферативный ответ на митоген in vitro и несколько увеличивает абсолютное количество циркулирующих Трег. Применение только ИФН-α2b существенно увеличивает экспрессию CD95-антигена на лимфоцитах, снижает митоген-индуцированную пролиферацию клеток и незначительно снижает абсолютное количество Трег в крови. Обе схемы интерферонотерапии способствуют улучшению цитотоксической активности лимфоцитов.

3. Изучение показателей общей и безрецидивной выживаемости позволяет сделать вывод о тенденции к улучшению отдаленных результатов в группе, где применена комбинация интерферонов.

Литература

1. Кузнецов В.П. (1998) Интерферон в каскаде цитокинов: исторические и современные аспекты. Антибиотики и химиотерапия, 5: 28–40.

2. Воронцова А.Л., Кудрявец Ю.И., Жильчук В.И. (2003) Интерфероны и их применение в клинической онкологии. Здоровье женщины, 4 (16): 8–12.

3. Шмелёв В.А. (2008) Интерферон-гамма, фактор некроза опухолей, тимозин-альфа1 — противоинфекционные и противоопухолевые цитокины и препараты. Москва, Медпрактика-М, 536с.

4. Биологические методы лечения онкологических заболеваний: принципы и практическое применение. Пер. с англ. / Под ред. В.Т. ДеВита, С. Хелманна, С.А. Розенберга. Москва, Медицина, 2002: 936с.

5. Kirkwood J.M., Ernstoff M.S., Davis S.A. et al. (1985) Comparison of intramuscular and intravenous of recombinant alpha-2 interferon in melanoma and other cancers. Ann. Intern. Med., 1 (103): 32–36.

6. Dorval T., Palangie T., Jouve M. et al. (1986) Clinical phase II trial of recombinant DNA interferon (interferon alpha-2b) in patients with metastatic malignant melanoma. Cancer, 2 (58): 215–218.

7. Mocellin S., Pasquali S., Rossi C.R. et al. (2010)Interferon alpha adjuvant therapy in patients with high risk melanoma: a system atic review and metaanalysis. J. Natl. Cancer Inst., 7 (102): 493–501.

8. Schiller J.H., Pugh M., Kirkwood J.M. et al. (1996) Eastern Cooperative Group Trial of interferon gamma in metastic melanoma: an innovative study design. Clin. Cancer. Res., 2: 29–36.

9. Meyskens F.L., Kopecky K., Samson S. et al. (1990) Recombinant human interferon-γ: adverse effects in high-risk stage I and II cutaneous malignant melanoma. J. Nat. Canc. Inst., 12 (82): 1071.

10. Anasanagasti L., Garcia Vega Y., Barcelona-Perez S. et al. (2009) Treatment of advanced, recurrent, resistant to previous treatments of basal squamous cell skin carcinomas with synergistic formulation of interfe­rons. BMC Cancer., 9: 1–12.

11. Ernstoff M.S., Gooding W., Nair S. et al. (1992) Immunological effects of treatment with sequentical administration of recombinan tinterferon gamma and alpha in patients with metastatic renal cell carcinoma during a phase I trial. CancerRes., 52: 851–856.

Коментарів немає » Додати свій

Leave a comment

Ім’я (required)

Mail (will not be published) (required)

Сайт

CAPTCHA Code