Хронічна мієлоїдна лейкемія (ХМЛ) є поширеним видом гемобластозів, його частка серед всіх злоякісних захворювань крові становить близько 15–20%. ХМЛ за розповсюдженістю посідає 3-тє місце після гострих лейкемій та хронічної лімфоїдної лейкемії у країнах Європи та Північної Америки. Щорічна захворюваність на ХМЛ становить 1–1,5 на 100 000 населення у всіх країнах. Виникнення ХМЛ пов’язано з утворенням філадельфійської хромосоми (Ph-хромосоми) внаслідок реципрокної транслокації між хромосомами 9 та 22. Результатом такої аберації є утворення химерного гена BCR-ABL, який продукує білок з вираженою тирозинкіназною активністю, що обумовлює послідовність подій у клітинах, які призводять до збільшення клітинної проліферації та, як наслідок, розвитку ХМЛ.

Поява якісно нового класу препаратів — інгібіторів BCR-ABL-тирозинкінази відкрило новий етап у лікуванні ХМЛ. Іматиніб мезилат став першим препаратом, застосування якого дозволило відновити нормальний гемопоез та отримати повну цитогенетичну ремісію у 65–85% хворих [1, 2]. Більш того, у частини з них отримано велику та повну молекулярну відповіді, що дало можливість підвищити показники виживаності без прогресії до 93%. Однак, незважаючи на успіхи при лікуванні іматинібом хворих на ХМЛ, частина пацієнтів відповідає на терапію незадовільно. У дослідженнях the International Randomized Study of Interferon vs STI571 (IRIS) показано, що приблизно 30% пацієнтів у хронічній фазі захворювання, котрі отримували іматиніб в якості 1-ї лінії терапії, не досягли повної цитогенетичної відповіді (ПЦВ) протягом 1 року лікування. Крім того, приблизно у 10% хворих виникає рецидив у 5-річний період спостереження, включаючи 10% пацієнтів з ПЦВ [3, 4]. Поява інгібіторів тирозинкінази (TKI) 2-го покоління — нілотинібу та дазатинібу, які перевищують за ефективністю іматиніб та мають більш виражену активність проти мутантних форм BCR-ABL-кінази, — до кінця не вирішує проблеми резистентності до TKI. На сьогоднішній день провідними фахівцями усього світу проводяться дослідження з вивчення механізмів первинної та вторинної резистентності до іматинібу. Наразі вони до кінця не з’ясовані. Однією із значущих причин розвитку стійкості до терапії вважається мутація гена BCR-ABL, що призводить до неможливості здійснення повноцінних міжмолекулярних взаємодій іматинібу та ABL-кінази і, як наслідок, до втрати чутливості клітин, що експресують мутантні гени BCR-ABL, до препарату [5, 6]. Іншою причиною резистентності є клональна еволюція з активацією додаткових онкогенних механізмів. Треба звернути увагу на те, що лише 50% випадків ХМЛ з резистентністю пов’язані з цими порушеннями. Решта залежить від інших механізмів. У теперішній час приділяють велику увагу вивченню феномена множинної медикаментозної стійкості (ММС). У розвитку ММС особливу роль відіграють білки, що входять у родину АВС-транспортерів (ATP Binding Cassette transporters), функція яких полягає у зв’язуванні АТФ для транспортування різних молекул через клітинні мембрани. У цьому плані заслуговує уваги один із трансмембранних білків-транспортерів, а саме Pgp-170, гіперекспресія якого супроводжується активним зниженням внутрішньоклітинного накопичення лікарських препаратів [7]. Pgp-170 кодується геном MDR-1, що розташований на довгому плечі хромосоми 7 (7q21). Його функцією є енергозалежний транспорт (еффлюкс) за межі клітини та зменшення внутрішньоклітинної концентрації багатьох лікарських засобів. Даний білок вважається маркером ММС ряду солідних пухлин людини, його експресія в пухлинних клітинах корелює з поганим прогнозом та низькою чутливістю до хіміотерапії. Pgp-170 демонструє широку специфічність до речовин з різною структурою та відповідно визначає стійкість клітин до значної кількості лікарських засобів. Досліджувалась участь даного білка у виникненні стійкості до лікування при ряді злоякісних захворювань крові. Було показано, що пацієнти з ХМЛ в стадії бластної кризи, чиї клітини експресували Pgp-170, мали гірший прогноз у порівнянні з Pgp-негативними випадками. При дослідженні крові хворих у хронічній фазі, фазах акселерації та бластної кризи було продемонстровано, що перехід хронічної фази у прогресуючі супроводжується розвитком ММС, яка пов’язана з високим синтезом у клітинах білка Pgp-170 [8, 9]. Підвищена експресія Pgp на лейкемічних лімфоцитах при хронічному лімфолейкозі співпадає з медикаментозною стійкістю клітин до дексаметазону, вінкристину [10]. При гострій мієлоїдній лейкемії гіперекспресія Pgp-170, за даними різних авторів, спостерігається у 20–50% первинних хворих. Деякі дослідники вважають Pgp-170 незалежним фактором прогнозу у хворих з нормальним каріотипом, оскільки існуючі дані переконливо показують необхідність віднесення хворих з гіперекспресією Pgp-170 та нормальним каріотипом до групи несприятливого прогнозу [11, 12]. Таким чином, при пошуку специфічних засобів лікування та застосуванні їх для лікування пацієнтів із системною патологією крові, важливо відслідковувати концентрацію у клітинах білка Pgp-170 [13, 14].

Оскільки зниження концентрації лікарської речовини в малігнізованих клітинах є однією з головних причин резистентності до терапії, вивчення ролі Pgp-170 як транспортного білка, що безпосередньо відповідає за нейтралізацію й виведення препарату з пухлинних клітин, в механізмах формування резистентності до терапії TKI становить значний інтерес.

У зв’язку з вищезазначеним, метою дослідження було визначення особливостей експресії мембранного глікопротеїну Pgp-170 на CD33-мієлоїдних клітинах та CD34-гемопоетичних клітинах попередниках периферичної крові (ПК) та кісткового мозку (КМ) у хворих на ХМЛ з різною відповіддю на терапію TKI.

Матеріали і методи

Рис. 1. Розподіл хворих на ХМЛ за статтю

Обстежено 37 хворих на ХМЛ, які отримували лікування TKI. Серед обстежених було 24 жінки та 13 чоловіків (рис. 1) віком від 19 до 71 року, середній вік становив 45,6±3,8 року.

Співвідношення жінок та чоловіків становило 1,85 : 1. Кількість хворих, молодших 60 років, становила 32 (86,5%), хворих літнього віку (старших 60 років) — 5 осіб (13,5%). Демографічні дані пацієнтів наведено в табл. 1.

Таблиця 1. Розподіл хворих на ХМЛ за статтю та віком

Більшість пацієнтів перебували у хронічній фазі захворювання (7 — у ранній хронічній фазі, решта — у пізній хронічній фазі), 2 — у фазі акселерації.

На терапії іматинібом (TKI 1-го покоління) перебували 27 пацієнтів, нілотинібом (TKI 2-го покоління) — 10. Двоє пацієнтів приймали TKI 2-го покоління в якості 1-ї лінії терапії, інші — після невдач лікування іматинібом.

Пацієнти з субоптимальною відповіддю впродовж 12 міс лікування та неефективністю терапії TKI були віднесені до групи резистентних хворих.

Для встановлення та підтвердження діагнозу хворих на ХМЛ застосовувалися загальноклінічні методи: оцінювання розмірів селезінки, печінки; дослідження ПК із визначенням кількості лейкоцитів, тромбоцитів, еритроцитів, рівня гемоглобіну та підрахунком лейкоцитарної формули; дослідження КМ з визначенням каріотипу, процентного вмісту Ph-клітин, за необхідністю проведення FISH-аналізу; цитохімічні дослідження при підвищеному вмісті недиференційованих клітин; молекулярно-генетичний метод (якісний та кількісний) полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для визначення типів BCR-ABL транскриптів та їх рівнів.

Кожні 6 міс хворі на ХМЛ проходили цитогенетичні та молекулярно-генетичні обстеження для проведення оцінки ефективності лікування препаратами TKI.

Критерієм цитогенетичної відповіді (ЦВ) була кількість залишкових Ph-позитивних клітин (згідно з рекомендаціями ELN — the European LeukemiaNet, 2010): ПЦВ — 0%, часткова цитогенетична відповідь (ЧЦВ) — 1–35%, велика ЦВ (повна+часткова) — 0–34%, мала ЦВ — 36–65%, мінімальна цитогенетична відповідь (МЦВ) — 66–95%, відсутність ЦВ — більше 95%.

Використовували критерії відповіді на терапію згідно з рекомендаціями ELN, 2010 (табл. 2).

Таблиця 2. Визначення рівня відповіді на терапію TKI

Досягнення повної гематологічної відповіді підтверджували наступні критерії: лейкоцити нижче 10×10/л, тромбоцити нижче 450×10/л, відсутність незрілих гранулоцитів, менше ніж 5% базофілів у ПК, нормальні розміри селезінки.

У зразках КМ та ПК вивчали коекс­пресію білка Pgp-170 на CD33, CD34-гемопоетичних клітинах. Для цього клітини фарбували моноклональними антитілами (Becton Dickinson, USA) за методикою фірми-виробника. Цитофлуориметричні дослідження проводили на проточному лазерному цитометрі FACScan (Becton Dickinson, USA) з аргоновим лазером з довжиною хвилі 488 нм. Даний прилад дозволяє враховувати 5 параметрів для кожної клітини: 2 параметри світлорозсіювання — пряме світлорозсіювання (FSC), що відображає розмір клітини, і бічне світлорозсіювання (SSC), що характеризує внутрішньоклітинну структуру клітини, а також 3 параметри флуоресценції (у залежності від застосовуваних флуорохромів) [15].

Збір даних проточної цитометрії проводили за допомогою програмного забезпечення LYSYS-II Ver. 1.1 (Becton Dickinson). Для аналізу результатів використовували программу WinMDI 2.8 (Joseph Trotter, Scripps Institute, La Jolla, CA).

Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою програм Microsoft Excel 2003 з пакету Microsoft Office 2003 та Statistica v. 6.0. Для кожного досліджуваного показника було визначено: його середнє значення, стандартне відхилення від середнього значення в межах однієї групи. Достовірність відмінностей значення даного показника визначали за t-критерієм Стьюдента для малих вибірок. Наявність кореляції між досліджуваними показниками оцінювали за допомогою непараметричного критерію Спірмана.

Результати та їх обговорення

Відповідь на терапію пацієнтів з ХМЛ оцінювали після 12 міс прийому TKI (табл. 3).

Таблиця 3. Характеристика пацієнтів за рівнем відповіді після 12 міс прийому TKI

Як видно з табл. 3, 51,5% хворих віднесено до групи резистентних хворих, 48,5% — до групи пацієнтів з оптимальною відповіддю на лікування.

Проблема резистентності до патогенетичної терапії TKI у хворих на ХМЛ являє особливий інтерес. Це пов’язано з тим, що такий вид терапії безпосередньо впливає на зниження експресії транскрипту гена BCR-Abl, сприяючи у хворих на ХМЛ досягненню повної молекулярної відповіді. Однак, незважаючи на очікувану ефективність, у пацієнтів з ХМЛ не завжди вдається досягнути повної цитогенетичної та молекулярно-генетичної відповіді, у зв’язку з чим продовжується пошук причин, що призводять до неефективності терапії TKI. Зокрема, відомо, що ефективність протипухлинної терапії залежить від внутрішньоклітинної концентрації в пухлинних клітинах лікувальних препаратів. Так, їх зменшення може бути однією з причин резистентності до терапії.

Одним із перспективних підходів до вирішення даної проблеми є вивчення особливостей експресії пухлинними клітинами Pgp-170, який є продуктом ABCB1 (MDR1) гена. Гіперекспресія Pgp-170-пухлинними клітинами асоційована з резистентністю до терапії TKI за рахунок активного внутрішньоклітинного зниження концентрації медикаментозних препаратів.

У хворих на ХМЛ з оптимальною відповіддю і резистентностю до терапії TKI вивчали особливості експресії мембранного білка-транспортера Pgp-170 на CD33-мієлоїдних клітинах та CD34-гемопоетичних клітинах-попередниках КМ і ПК. Результати проведених досліджень узагальнено в табл. 4 у вигляді усереднених значень, отриманих на підставі визначення відсотка позитивних клітин, що експресували досліджувані маркери.

Таблиця 4. Коекспресія білка Pgp-170 на CD33-, CD34-гемопоетичних клітинах ПК і КМ хворих на ХМЛ з оптимальною відповіддю і резистентністю до терапії TKI (відсоток позитивних клітин, M±m)

Порівняльний аналіз між групами показав, що в ПК кількість CD33-позитивних клітин, які не експресували антиген Pgp-170, була статистично вірогідно вища у хворих на ХМЛ з оптимальною відповіддю (у 1,3 раза, p+Pgp-170-гемопоетичних клітин також була вірогідно вища (у 1,8 раза, p+ Pgp-170-гемопоетичних клітин імовірно перевищує аналогічне значення в КМ (у 1,3 раза, p+ Pgp-170–гемопоетичних клітин перевищує аналогічне значення в КМ (у 1,8 раза, p+ Pqp-170 — гемопоетичних клітин імовірно перевищує аналогічне значення в КМ (у 1,3 раза, р+ Pqp-170—гемопоетичних клітин перевищує аналогічне значення в КМ (у 1,8 раза, р

Водночас аналіз результатів по групах показав достовірне зростання в ПК хворих на ХМЛ з резистентністю до терапії TKI кількості CD33-мієлоїдних клітин, які коекспресують білок Pgp-170 (у 7,6 раза, p+Pgp-170-гемопоетичних клітин, однак показники не досягли статистичної значущості. З отриманих даних випливає, що в ПК хворих на ХМЛ із резистентністю до терапії спостерігається статистично достовірне (у 5,3 раза, p+Pgp-170-клітин у порівнянні з КМ на відміну від хворих з оптимальною відповіддю, в яких не виявлено достовірних розбіжностей за кількістю CD33-клітин, які коекспресують Pgp-170 у КМ і ПК.

Слід зазначити, що в ПК хворих на ХМЛ із резистентністю до терапії кількість CD34-гемопоетичних клітин-попередників з високим ступенем вірогідності перевищувала аналогічне значення у пацієнтів з оптимальною відповіддю (у 12,8 раза, p+-клітин ПК вірогідно перевищувала аналогічне значення в КМ (у 1,7 раза, p

Порівняльний аналіз між групами показав, що кількість у ПК CD34- клітин-попередників, коекспресуючих білок Pgp-170, у хворих на ХМЛ із резистентністю до терапії є статистично вірогідно вищою (у 3,6 раза, p+Pgp-170-клітин була також вірогідно вищою (у 2,6 рази, p+Pgp-170-гемопоетичних клітин у ПК і КМ.

Отже, результати досліджень свідчать, що у хворих на ХМЛ із резистентністю до терапії TKI в ПК збільшувалася кількість CD33-мієлоїдних клітин, які коекспресують білок Pgp-170, у порівнянні з пацієнтами з оптимальною відповіддю.

Рис. 2. Кореляційний взаємозв’язок між кількістю CD33Pgp-170-клітин і кількістю Ph-клітин КМ у пацієнтів з резистентністю до терапії TKI

Проведений кореляційний аналіз (рис. 2) показав, що збільшення кількості гемопоетичних клітин в КМ, які експресують Pgp-170, пов’язане зі зростанням Ph-позитивних клітин (r=0,893, p

Таким чином, у групі хворих на ХМЛ, які були резистентними до терапії TKI, в ПК та КМ спостерігалося збільшення кількості CD33 та CD34-клітин, що коекспресують білок Pgp-170, у порівнянні з пацієнтами, у яких визначалась оптимальна відповідь. Порівняння одержаних результатів з клініко-гематологічними та цитогенетичними даними підтверджує участь Pgp-170 в формуванні резистентності до терапії TKI. Отримані результати узгоджуються з даними інших дослідників відносно значення Pgp-170 в розвитку резистентності до протипухлинної терапії у хворих на злоякісні захворювання крові, у тому числі ХМЛ [7, 9, 11, 12].

Висновки

1) У групі хворих на ХМЛ, у яких відзначалася резистентність до терапії TKI, встановлено достовірне збільшення кількості CD33-мієлоїдних клітин та CD34-гемопоетичних клітин-попередників, що експресують трансмембранний глікопротеїн Pgp-170.

2) Відзначався прямий кореляцій­ний взаємозв’язок між кількістю CD33Pgp- 170 та Ph-клітин КМ.

Література

1. Druker B.J., Guilhot F., OBrien S.G. et al. (2006) Five-year follow-up of patients receiving imatinib for chronic myeloid leukemia. N.Engl.J.Med., 355(11): 2408–2417.

2. Kantarjian H.M., Cortes J., Guilhot F. et al. (2007) Diagnosis and management of chronic myeloid leukemia: a survey of American and European practice patterns. Cancer, 109(7): 1365–1375.

3. Zhang W.W., Cortes J.E., Yao H. et al. (2009) Predictors of primary imatinib resistance in chronic myelogenous leukemia are distinct from those in secondary imatinib resistance. J Clin Oncol, 27(22): 3642–3649.

4. Jabbour E., Cortes J.E., Kantarjian H.M. et al. (2009) Suboptimal response to or failure of imatinib treatment for chronic myeloid leukemia: what is the optimal strategy? Mayo Clin Proc, 84(2): 161–169.

5. Дягиль И.С. (2009) Субоптимальный ответ при лечении иматинибом ХМЛ как критерий риска развития резистентности. Укр. журнал гематології та трансфузіології, 4(9): 27–29.

6. Hughes T., Hochhaus A. (2009) Clinical strategies to achieve an early and successful response to tyrosine kinase inhibitor therapy. Semin Hematol., 46(2 Suppl 3): 111–115.

7. Legrand O., Zompi S., Perrot J.Y. et al. (2004) P-glycoprotein and multidrug resistance associated protein-1 activity in 132 acute myeloid leukemias according to FAB subtypes and cytogenetics risk groups. Haematologica, 89(1): 34–41.

8. Schinkel A.H., Arceci R.J., Smit J.J. et al. (1993) Binding properties of monoclonal antibodies recognizing external epitopes of the human MDR1 P-glycoprotein. Int. J. Cancer, 55: 478–484.

9. Schrenk D., Baus P.R., Ermel N. et al. (2001) Up-regulation of transporters of the MRP family by drugs and toxins. Toxicol Lett, 120(1–3): 51–57.

10. Свирновский А.И., Сергиенко Т.Ф., Шман Т.В. и др. (2009) Влияние єкспрессии и функции транспортных белков множественной лекарственной устойчивости Р-гликопротеина и BCRP на лекарственную чувствительность in vitro при хроническом лимфоцитарном лейкозе. Гематология и трансфузиология, 1(54): 10–14

11. Damiani D., Tiribelli M., Calistri E. et al. (2006) The prognostic value of P-glycoprotein (ABCB) and breast cancer resistance protein (ABCG2) in adults with de novo acute myeloid leukemia with normal karyotype. Haematologica, 825(91): 8.

12. Захаров О.Д., Рыбалкина Е.Ю., Волкова М.А. и др. (2006) Маркеры множественной лекарственной устойчивости при острых лейкозах. Онкогематология, 1(1–2): 9–15.

13. Beck W.T., Grogan T.M., Willman C.L. et al. (1996) Methods to detect P-glycoprotein-associated multidrug resistance in patients’ tumors: consensus recommendations. Cancer Research, 56: 3010–3020.

14. Borst P., Evers R., Kool M. et al. (2000) A family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins. J Natl Cancer Inst., 92(16): 1295–1302.

15. Пожарисский К.М., Леенман Е.Е. (2000) Значение иммунологических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний. Арх. Патологии, (5): 3–11.

Коментарів немає » Додати свій

Leave a comment

Ім’я (required)

Mail (will not be published) (required)

Сайт

CAPTCHA Code