Вступ

Меланома шкіри є найбільш небезпечною формою злоякісних новоутворень шкіри. За даними Національного канцер-реєстру України [1], у 2010 р. на меланому шкіри захворіло 2829 осіб, що спричинило 1070 випадків смерті. Результати лікування хворих на меланому шкіри все ще залишаються незадовільними через раннє метастазування, швидке прогресування і низьку чутливість пухлинних клітин до хіміопрепаратів. 5-річна виживаність становить від 90% при І стадії до 1–4% при ІV стадії захворювання. Головною і в той же час дуже складною для вирішення проблемою ефективного лікування цієї категорії хворих є запобігання розвит­ку метастазів. З метою профілактики останніх використовується інтерферонотерапія, що включена до стандартів лікування хворих з І–ІІІ стадіями меланоми шкіри [2], проте, за даними різних авторів, її ефективність становить 16–48% [3–5].

Удосконалення існуючих схем застосування інтерферону-α (ІФН-α) проводиться як шляхом зміни доз та режимів введення препарату, так і доповнення іншими цитокінами, зокрема, інтерфероном γ [6, 7]. За даними американських дослідників [8], застосування високодозової терапії ІФН-α в неоад’ювантному режимі є ефективним методом лікування хворих на меланому шкіри IІІВ–IІIС стадії: в 55% випадків відмічають об’єктивну відповідь на терапію. В науково-дослідному відділенні пухлин шкіри та м’яких тканин Національного інституту раку (заві­дувач — доктор медичних наук С.І. Коровін) розпочато клінічне дослідження впливу неоад’ювантної інтерферонотерапії на ефективність лікування пацієнтів з меланомою шкіри з метастазами в реґіонарні лімфовузли (ММРЛВ). Врахування особливостей біологічної відповіді організму хворих [9] на біотерапію є важливим аспектом її впровадження. Саме тому вивчення впливу неоад’ювантного курсу ІФН-α на імунну систему хворих на ММРЛВ стало метою даного дослідження.

Матеріал та методи

У дослідження включено 27 хворих з гістологічно підтвердженим діагнозом ММРЛВ IІІВ–IІIС стадії, які надали письмову поінформовану згоду на участь у дослідженні. Серед пацієнтів було 15 чоловіків та 12 жінок; середній вік хворих становив 51,7±2,6 року (від 24 до 71 року).

Шляхом рандомізації хворі були розподілені на контрольну (16) та основну (11) групи. Представлений дизайн дослідження (рисунок) включає режими застосування ІФН-α у хворих досліджуваних груп та етапи отримання матеріалу для імунологічних досліджень. Хворим конт­рольної групи було розпочато індукційний курс інтерферонотерапії (рекомбінантний ІФН-α2b підшкірно по 9 млн МО щоденно упродовж 23 днів) через 8–10 діб після хірургічного лікування. По закінченні індукційного курсу хворі отримували підтримувальний курс інтерферонотерапії (рекомбінантний ІФН-α2b підшкірно по 3 млн МО 3 рази на тиждень упродовж 12 міс). Хворі основної групи розпочинали лікування з індукційного курсу рекомбінантним ІФН-α2b (підшкірно по 9 млн МО щоденно упродовж 23 днів), після цього отримували хірургічне лікування, через 8–10 діб після якого розпочинали підтримувальний курс терапії із застосуванням ІФН-α2b (підшкірно по 3 млн МО 3 рази на тиждень упродовж 12 міс).

За період спостереження зразки крові від хворих отримували 4 рази: 1-й етап – безпосередньо перед початком лікування; 2-й — через 8–10 днів після хірургічного втручання (контрольна група) або після індукційного курсу рекомбінантним ІФН-α2b в неоад’ювантному режимі (основна група); 3-й — після індукційного курсу рекомбінантним ІФН-α2b в ад’ювантному режимі (контрольна група) або через 8–10 днів після хірургічного лікування (основна група); 4-й – через 3 міс від початку підтримувального курсу терапії ІФН-α2b. Імунологічні дослідження після закінчення повного курсу лікування (5-й етап) – продовжуються.

В якості контрольних імунологічних показників застосовували величини, що були отримані при обстеженні 76 практично здорових людей (ПЗЛ).

Дизайн проведення даного дослідження схвалено локальною комісією з питань етики Національного інституту раку МОЗ України.

Методи дослідження. Кількість лейкоцитів в периферичній крові та лейкоцитарну формулу визначали загальноприйнятим методом [10]. Фенотипічні характеристики лімфоцитів встановлювали за допомогою методу проточної цитофлуориметрії [11, 12] з використанням моноклональних антитіл (МКАТ) до CD3, CD19, CD4, CD8, CD16, мічених флуоресцеїнізотіоцианатом (Сорбент, Росія), CD25, мічених фікоеритринцианіном-5, CD127, CD5, мічених фікоеритрином (Beckman Coulter, США).

Для визначення регуляторних Т-клітин (Трег) використовували багатопараметричний аналіз з багатоетапним введенням логічних обмежень. Трег виявляли серед CD4-лімфоцитів за наявністю високої експресії CD25 в поєднанні з низькою або негативною експресією CD127 (CD4CD25highCD127low-neg) [13–15]. Для встановлення субпопуляційного складу В-лімфоцитів використовували двопараметричний аналіз з визначенням CD5-антигену та лінійноспецифічного маркера В-лімфоцитів – CD19. Серед CD19-лімфоцитів визначали В1-клітини за експресією молекули CD5, В2-клітини – за її відсутністю [15].

МКАТ з гепаринізованою кров’ю (20 Од/мл гепарину (Біохемі, Австрія)) у співвідношенні 1:5 інкубували у темряві упродовж 30 хв при температурі 20–25 °С; додавали 2,0 мл лізуючого розчину та витримували 10 хв за тих же умов. Потім клітини двічі відмивали забуференим ізотонічним розчином NaCl (забуферений фізіологічний розчин — ЗФР) та фіксували 1% розчином параформальдегіду. Результати обчислювали на проточному цитофлуориметрі FACScan (Becton Dickinson, США) з використанням програми Cell Quest. Гейт популяції клітин встановлювали на підставі комбінації прямого та бокового світлорозсіювання і розміру клітин [16]. Під час обліку результатів підраховували 2·10 лімфоцитів при визначенні основних популяцій та 10·10 – при визначенні мінорних субпопуляцій (Трег, В1- та В2-лімфоцитів). Імунорегуляторний індекс (ІРІ) визначали як співвідношення СD4/СD8.

Методи обробки результатів. Статистична обробка отриманих даних проведена із використанням Excel (MS Office 2003, XP) та програми STATІSTІCA 6,0 (StatSoft Inc., США). Результати дослідження представляли у вигляді медіани та значень 10 та 90% квантилів. Для визначення вірогідності розбіжностей (р) показників незалежних груп застосовували критерій Манна — Уїтні, показників групи в динаміці лікування – одновибірковий критерій Уїлкоксона [17, 18]. Розбіжності оцінювали як вірогідні при р<0,05.

Результати та обговорення

До початку лікування у лейкограмі хворих на ММРЛВ контрольної та основ­ної груп не виявлено суттєвих (р>0,05) відхилень при порівнянні з такою у ПЗЛ за винятком лімфоцитопенії (р<0,05) у хворих основної групи (табл. 1 та 2).

Таблиця 1. Зміни в лейкограмі у хворих на ММРЛВ контрольної групи в динаміці інтерферонотерапії

*Розбіжність при порівнянні з показником до лікування статистично вірогідна (р<0,05); **розбіжність при порівнянні з показником на 2-му етапі статистично вірогідна (р<0,05); ***розбіжність при порівнянні з показником ПЗЛ статистично вірогідна (р < 0,05).

Після індукційного курсу ІФН-α2b, проведеного пацієнтам контрольної групи в ад’ювантному режимі (3-й етап), встановлено, що вміст лейкоцитів у периферичній крові вірогідно знижується за рахунок сегментоядерних нейтрофілів, базофілів та лімфоцитів порівняно з таким у ПЗЛ. При цьому відбувається збільшення (р<0,05) відносної кількості великих гранулярних лімфоцитів проти показника, що реєструється на 2-му етапі дослідження.

Після аналогічного курсу інтерферо­нотерапії, проведеного пацієнтам основ­ної групи в неоад’ювантному режимі (2-й етап), виявлено, що вміст лейкоцитів у периферичній крові також значно зменшується (р<0,05) за рахунок сегментоядерних нейтрофілів, еозинофілів, базофілів та лімфоцитів порівняно з такими у ПЗЛ (див. табл. 2). Проте, на відміну від хворих контрольної групи, у пацієнтів основної групи відмічали збільшення (р<0,05) відносної кількості лімфоцитів порівняно з вихідним значенням та відносного вмісту моноцитів проти такого у ПЗЛ.

Таблиця 2. Зміни в лейкограмі у хворих на ММРЛВ основної групи в динаміці інтерферонотерапії

*Розбіжність при порівнянні з показником до лікування статистично вірогідна (р<0,05); **розбіжність при порівнянні з показником на 2-му етапі дослідження статистично вірогідна (р<0,05); ***розбіжність при порівнянні з показником на 3-му етапі дослідження статистично вірогідна (р<0,05); ****розбіжність при порівнянні з показником ПЗЛ статистично вірогідна (р<0,05).

Важливо підкреслити, що у хворих основної групи на 8-10-ту добу після хірургічного лікування (3-й етап) кількість лейкоцитів та їх форм у периферичній крові відновлюється до рівня у ПЗЛ. На цьому етапі дослідження особливо чутливими виявились сегменто­ядерні нейтрофіли, абсолютна кількість яких значно збільшилась порівняно з попереднім значенням (р<0,05), що може бути обумовлено особливостями післяопераційного періоду.

У хворих основної групи на тлі застосування в післяопераційний період підтримувального курсу ІФН-α2b упродовж 3 міс (4-й етап) розвивається лейкоцитопенія за рахунок сегментоядерних нейтрофілів при порівнянні з аналогічними показниками у ПЗЛ (р<0,05). У той же час виявлено зсув лейкоцитарної формули вліво за рахунок збільшення кількості паличкоядерних нейтрофілів відносно такої у ПЗЛ (р<0,05), як і в пацієнтів контрольної групи на цьому етапі спостереження. Натомість, на відміну від них, у хворих основної групи суттєво підвищується відносний вміст моноцитів та великих гранулярних лімфоцитів при порівнянні з показниками до інтерферонотерапії (р<0,05).

При дослідженні популяційного скла­ду лімфоцитів периферичної крові у хворих на ММРЛВ основ­ної групи до лікування встановлено, що лімфоцитопенія розвивається за рахунок зниженого вмісту всіх популяцій: Т-, В-лімфоцитів та природних кілерних клітин відносно такого у ПЗЛ (р<0,05) (табл. 3). У свою чергу, Т-лімфоцитопенія зумовлена суттєвим (р<0,05) зниженням кількості як CD4-, так і CD8-лімфоцитів. Крім того, виявлено підвищений (р<0,05) відносний вміст Трег порівняно з аналогічним показником у ПЗЛ, як і в хворих контрольної групи на даному етапі дослідження.

Таблиця 3. Зміни популяційного складу ЛПК у хворих на ММРЛВ основної групи в динаміці інтерферонотерапії

*Розбіжність при порівнянні з показником до лікування статистично вірогідна (р<0,05); **розбіжність при порівнянні з показником на 2-му етапі дослідження статистично вірогідна (р<0,05); ***розбіжність при порівнянні з показником на 3-му етапі дослідження статистично вірогідна (р<0,05); ****розбіжність при порівнянні з показником ПЗЛ статистично вірогідна (р<0,05); ^розбіжність при порівнянні з показником в контрольній групі статистично вірогідна (р<0,05).

Індукційний курс ІФН-α2b, прове­дений пацієнтам основної групи в нео-ад’юван­тному режимі (2-й етап), не усунув вищезазначені порушення, за винятком відновлення вмісту Т-хелперів до рівня у ПЗЛ (див. табл. 3). Цей етап лікування характеризується значним зменшенням абсолютної кількості В1-клітин порівняно з подібним у ПЗЛ (р<0,05), що також виявлено і у хворих контрольної групи після застосування аналогічної схеми інтерферонотерапії в ад’ювантному режимі (табл. 4).

Таблиця 4. Зміни популяційного складу ЛПК у хворих на ММРЛВ контрольної групи в динаміці інтерферонотерапії

*Розбіжність при порівнянні з показником ПЗЛ статистично вірогідна (р<0,05).

На 3-му етапі дослідження (8-10-та доба після хірургічного лікування) у хворих основної групи — на відміну від пацієнтів контрольної — виявлено нівелювання порушень вмісту основ­них популяцій лімфоцитів. У складі Т-лімфоцитів відбувається перерозподіл серед субпопуляцій: відносний вміст Т-хелперів збільшується на тлі зниженого відносного вмісту цитотоксичних Т-клітин (їх кількість вірогідно нижча, ніж в контрольній групі), що позначається на імунорегуляторному індексі, значення якого перевищує показник в контрольній групі та у ПЗЛ (р<0,05). При цьому зберігається підвищений рівень Трег у периферичній крові, а абсолютна кількість В1-клітин суттєво збільшується порівняно з попереднім значенням (р<0,05).

На тлі застосування в ад’ювантному режимі підтримувального курсу ІФН-α2b упродовж 3 міс у пацієнтів основної групи (4-й етап) виявлено істотне зниження (р<0,05) абсолютної кількості Т-лімфоцитів та природних кілерних клітин відносно показників у ПЗЛ (див. табл. 3). Серед субпопуляцій Т-лімфо­цитів зберігаються вищезазначені зміни з боку вмісту CD8-клітин та Трег. Відносна кількість В1-клітин значно збільшується порівняно з такою на попередніх етапах лікування та у ПЗЛ (р<0,05).

Таким чином, проведення індукційного курсу ІФН-α2b у хворих на ММРЛВ незалежно від схеми застосування (до або після хірургічного лікування) призводить до розвитку лейкоцитопенії за рахунок нейтрофілів та лімфоцитів. Відновлення вмісту лейкоцитів, зокрема лімфоцитів, після оперативного втручання відмічають лише на тлі неоад’ювантного застосування ІФН-α2b. Послідовне ад’ювантне застосування індукційного та підтримувального курсів інтерферонотерапії призводить до відновлення кількості лімфоцитів периферичної крові хворих на ММРЛВ до фізіологічної норми, але не усуває лімфоцитопенію. Натомість, проведення в ад’ювантному режимі підтримувального курсу ІФН-α2b асоціюється з лейкоцитопенією при збереженні вмісту лімфоцитів на рівні ПЗЛ. Застосування підтримувального курсу інтерферонотерапії у хворих на ММРЛВ обох досліджуваних груп викликає зсув лейкоцитарної формули вліво.

Отже, обидві схеми інтерферонотерапії по-різному впливають на субпопуляційний склад Т-лімфоцитів периферичної крові у хворих на ММРЛВ. Застосування індукційного курсу ІФН-α2b в ад’ювантному режимі не відновлює знижений вихідний вміст Т-лимфоцитів, але сприяє зменшенню кількості Трег. Натомість, застосування ІФН-α2b в нео­а­д’ювантному режимі запобігає розвитку Т-лімфоцитопенії після хірургічного втручання, проте не усуває підвищений вміст Трег.

Застосування індукційного курсу ІФН-α2b у хворих обох досліджуваних груп призводить до зниження вмісту В1-клітин відносно таких у ПЗЛ. Послідовне застосування індукційного та підтримувального курсів інтерферонотерапії в ад’ювантному режимі призводить до відновлення популяційного та субпопуляційного складу лімфоцитів периферичної крові до меж фізіологічної норми. Підтримувальний курс ІФН-α2b, проведений в ад’ювантному режимі такої дії не спричиняє, зокрема не усуває підвищений вміст Трег та В1-клітин.

Які наслідки для пацієнтів стосовно перебігу пухлинного процесу та прогнозу захворювання матимуть описані вище зміни в імунореактивності організму, буде з’ясовано після клінічної оцінки ефективності досліджуваних схем інтерферонотерапії. Проте одне залишається очевидним: в умовах інвазії пухлини в лімфоїдну тканину імунна система хворих реагує по-різному залежно від застосованої схеми лікування.

Висновки

1. Індукційний курс ІФН-α2b незалежно від схеми застосування (до або після хірургічного лікування) супроводжується розвитком лейкоцитопенії безпосередньо після його закінчення; у разі застосування цього курсу в неоад’ювантному режимі вміст лейкоцитів та лімфоцитів в периферичній крові хворих відновлюється після оперативного втручання.

2. Неоад’ювантне застосування індукційного курсу ІФН-α2b сприяє відновленню після хірургічного лікування кількості Т-лімфоцитів в периферичній крові до фізіологічної норми, але не усуває підвищений вміст Трег. Аналогічний курс інтерферонотерапії в ад’ювантному режимі не відновлює знижений вміст Т-лімфоцитів, проте сприяє зменшенню рівня Трег в циркуляції.

ЛІТЕРАТУРА

1. Федоренко З.П., Гайсенко А.В., Гулак Л.О. та ін. (2011) Рак в Україні, 2009–2010. Захворюваність, смертність, показники діяльності онкологічної служби. Бюл. Національного канцер-реєстру України. К., 12: 118 с.

2. Kirkwood J.M., Tarhini A.A., Moschos S.J. et al. (2008) Adjuvant therapy with high-dose interferon alpha 2b in patients with high-risk stage IIB/III melanoma. Nat. Clin. Pract. Oncol., 5(1): 2–3.

3. Keilholz U., Punt C.J., Gore M. et al. (2005) Dacarbazine, cisplatinand interferon-alfa-2b with or without interleukin-2 in metastatic melanoma: a randomized Phase III trial (18951) of the European Organization for Research and Treatment of Cancer Melanoma Group. J. Clin. Oncol., 23: 6747–6755.

4. Eton O., Legha S.S., Bedikian A.Y. et al. (2002) Sequential biochemotherapy versus chemotherapy for metastatic melanoma: results from a Phase III randomized trial. J. Clin. Oncol., 20: 2045–2052.

5. Atkins M.B., Lee S., Flaherty L.E. et al. (2003) A pros­pective randomized Phase III trial of concurrent biochemotherapy (BCT) with cisplatin, vinblastine, dacarbazine (CVD), IL-2 and interferon alpha-2b (IFN) versus CVD alone in patients with metastatic melanoma (E3695). An ECOG-coordinated intergroup trial. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 22: 708.

6. Абрамов М.Е., Гуторов С.Л., Славина Е.Г. и др. (2009) Химиотерапия диссеминированной меланомы кожи с включеним ингарона. Клинико-иммунологические исследования. Рос. биотер. журн., 8(1): 64–74.

7. Фільчаков Ф.В., Шуміліна К.С., Льон Г.Д. та ін. (2011) Вплив різних схем інтерферонотерапії на функціональну активність лімфоцитів у хворих на меланому шкіри. Імунологія та алергологія, 2: 120–125.

8. Stergios J., Moschos, Howard D. et al. (2006) Neoad­juvant Treatment of Regional Stage IIIB Melanoma With High-Dose Interferon Alfa-2b Induces Objective Tumor Regression in Association With Modulation of Tumor Infiltrating Host Cellular Immune Responses. J. of Clin. Oncol., 24(19): 3164–3171.

9. Фільчаков Ф.В., Кукушкіна С.М., Шуміліна К.С. та ін. (2011) Особливості імунного статусу у хворих на меланому шкіри на різних стадіях пухлинного процесу, Клиническая онкология, 2 (2): 36–40.

10. Руководство по клинической лабораторной диагностике: в 2 ч. (1982) Под ред. Базарновой М.А. 2-я ч.: 175 с.

11. Пинегин Б.В., Ярилин А.А., Симонова А.В. и др. (2001) Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека. Пособие для врачей-лаборантов. М., 55 с.

12. Вопросы современной проточной цитометрии. Клиническое применение (2008) Под ред. С.В. Хайдукова, А.В. Зурочки. Челябинск, 195 с.

13. Liu W., Putman A.L., Xu-Yu Z. et al. (2006) CD127 expres­sion inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+Treg cells. J. Exp. Med., 203(7): 1700–1711.

14. Seddiki N., Santner-Nanan B., Martison J. et al. (2006) Expression of interleukin(IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J. Exp. Med., 203(7): 1693–1700.

15. Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Тотолян А.А. и др. (2009) Основные и малые популяции лимфоцитов периферической крови человека и их нормативные значения (методом многоцветного цитометрического анализа). Мед. иммунол., 11( 2–3): 227–238.

16. Хайдуков С.В. (2007) Подходы к стандарти­за­ции метода проточной цитометрии для иммуно­фенотипирования. Настройка цитометров и под­го­товка протоколов для анализа. Мед. иммунол., 9(6): 569–574.

17. Лапач С.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н. (2001) Статистические методы в медико-биологических исследованиях с использованием Excel. К.: Морион, 408 с.

18. Мінцер О.П., Вороненко Ю.В., Власов В.В. (2003) Оброблення клінічних і експериментальних даних у медицині. Кн. 5: Навч. посіб. Інформаційні технології в охороні здоров’я і практичній медицині: У 10 кн. За ред. О.П. Мінцера. К.: Вища школа, 350 с.

Коментарів немає » Додати свій

Leave a comment

Ім’я (required)

Mail (will not be published) (required)

Сайт

CAPTCHA Code