Вступ

На сьогодні велика увага дослідників приділяється вивченню ролі окремих генів у розвитку різних патологічних процесів. Патогенез цілого ряду захворювань пов’язаний з одночасним впливом пошкоджувальних факторів навколишнього середовища і порушень в генах. Такі захворювання називають мультифакторіальними, вони становлять 92% усієї патології людини [1, 2, 5].

При лікуванні раку грудної залози (РГЗ) пошкоджувальна дія опромінення та хіміотерапії розповсюджується не лише на пухлину, але й на ряд органів. Фіброз легень і печінки, мукозити, судинні та тромбоемболічні ускладнення хіміо- та променевого лікування можна віднести до мультифакторіальних захворювань і ступінь їх вираженості при стандартних схемах хіміо- та променевої терапії, очевидно, зумовлений генетичними відмінностями.

Фібротичні зміни в органах у відповідь на дію променевої терапії відбуваються завдяки активації прооксидантних та профібротичних факторів, рівень яких в організмі є генетично детермінованим. В попередніх дослідженнях нами було встановлено, що зниження резистентності легеневої тканини до хіміо- і радіо­терапії у щурів різних генетичних ліній було пов’язано зі збільшенням в сироватці крові рівня трансформуючого фактору росту (ТФР-β₁) та С-реактивного протеїну (СРП) на тлі зниження активності ендогенної антиоксидантної системи [7].

Один із компонентів фіброгенезу — депозиція екстрацелюлярного матриксу, а саме — порушення рівноваги між синтезом колагену і його деградацією [11]. У розщепленні колагену основна роль належить протеолітичним ферментам — матриксним металопротеїназам (ММР), що належать до групи катепсинів. ММР відіграють важливу роль в ембріо-, морфо-, ангіогенезі, інволюції тканин, а також у деградації позаклітинного матриксу при аутоімунних хворобах, фіброзі легень, інвазії пухлинних клітин і метастазуванні [13]. В експерименті доведена роль ММР-12 при розвитку індукованої сигаретним димом ефіземи. Описана роль мутації АG гена ММP-12 при хронічних обструктивних хворобах легень у людей [8]. Доведено, що у гомозиготних носіїв алелю А ризик пневмофіброзу зростає майже втричі [14]. Активацію ММP-12 розглядають як один із механізмів реалізації профіброгенної дії ТФР-β1 в легеневій тканині [10]. Однак до сьогодні поліморфізм гена ММP-12 у хворих на РГЗ і його роль в ускладненнях хіміо- та променевого лікування не вивчали.

Відомо, що порушення обміну сульф­гідрильної амінокислоти гомоцистеїну — гіпергомоцистеїнемія — є одним із факторів печінкового та кардіального фіброгенезу [4, 15]. Є повідомлення і про можливу патогенетичну роль гомоцистеїну у розвитку та прогресуванні РГЗ [12]. Гіпергомоцистеїнемія є незалежним від гіперліпідемії чинником ризику розвитку атеросклерозу, артеріальної гіпертензії, цукрового діабету, аденоми і раку товстого кишечнику, склерозу та фіброзу внутрішніх органів.

Відомо, що рівень гомоцистеїнемії генетично-детермінований і залежить від поліморфізму С677Т в гені метилентетрагідрофолатредуктази (МТНFR) — ферменту, який регулює реметилування гомоцистеїну. У осіб, гомозиготних за даною мутацією (генотип Т/Т), особ­ливо часто розвиваються побічні ефекти при хіміотерапії злоякісних пухлин. Доведено, що поліморфізм С677Т впливає на ефективність застосування протипухлинних засобів флуороурацилу та метотрексату [9, 16]. Можливо, генотипування за поліморфізмом С677Т дозволить виділити різні генотипи за фармакогенетичними ефектами хіміотерапії у різних пацієнтів, що дозволить персоніфікувати фармакотерапію [6].

Наявність у хворих на РГЗ Т/Т генотипу є фактором, обтяжуючим перебіг захворювання [3]. Нами було показано, що хворі з РГЗ — гомозиготи ТТ мають підвищену схильність до розвитку хіміорадіоіндукованого пневмофіброзу. Можливо, цей ефект реалізується через ряд біохімічних порушень (як гіпергомоцистеїнемія, активація процесів перекисного окиснення ліпідів (ПОЛ), запалення та фіброгенезу). Тому вивчення впливу мутації генів МТНFR та ММP на біохімічні зміни в сироватці крові хворих на РГЗ допоможе більш повно розкрити механізм розвитку постхіміо-променевих ускладнень і розробити патогномонічні методи їх профілактики.

Метою дослідження було вивчити вплив мутації С677Т гена МТНFR та А-82G гена ММP-12 на рівень гомоцистеїну, активність прозапальних, прооксидантних та профібротичних факторів в сироватці крові хворих на РГЗ.

Матеріали і методи дослідження

В дослідженні взяли участь 72 хворих репродуктивного віку (47,9±8,5 року) з І–ІІ стадією РГЗ, які проходили лікування у Вінницькому обласному клінічному онкодиспансері в 2009–2011 pp. В усіх хворих визначали поліморфізм С677Т гена МТНFR та rs2276109 A-82G гена MMP-12. Геномну ДНК виділяли з лейкоцитів периферійної крові за допомогою реагента «ДНК-експрес-кров», поліморфну ділянку генів ампліфікували методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням алельспецифічних олігонуклеотидних праймерів (ЛіТех, Росія). Ампліфікацію проводили на ампліфікаторі «Терцик» (ДНК-Технологія, Росія). Продукти ампліфікації виявляли за допомогою електрофорезу в 3% агарозному гелі при напрузі 10–15 V на 1 см гелю. Гелі фарбували етидіумом бромідом з наступною візуалізацією результатів в УФ-світлі.

Вміст вільного оксипроліну в сироватці крові визначали за реакцією з пара-диметиламінобензальдегідом. Вміст СРП — імуноферментним методом за набором «hsCRP ELISA» (DRG, США) відповідно до інструкції фірми-виробника. Вміст ТФР-β_l — за набором «TGF-β_l» (Biosource, Europe S.A.). Рівень загального гомоцистеїну в сироватці крові визначали імуноферментним методом за набором «Homocysteine ЕІА» (Axis-Shield, Англія) на аналізаторі STAT FAX 303/PLUS. Вміст інтерлейкіну-6 (ІЛ-6) в сироватці крові визначали імуноферментним методом з використанням стандартного набору «IL-6 ELISA» (Diaclone, Франція) відповідно до інструкції фірми-виробника. Концентрацію малонового діальдегіду та карбонільних груп білків визначали в сироватці крові.

Для оцінки результатів дослідження обчислювали значення середнього арифметичного і похибку середнього (Х±m). Для представлення якісних характеристик використовували показник частоти ознаки (%) і вказували похибку частки (%). Для порівняння середніх показників вибірок до і після дії застосовували критерій Стьюдента для зв’язаних вибірок (у разі нормального закону розподілу), або Т-критерій Вілкоксона (у разі відмінності закону розподілу від нормального). Відмінність вважалася статистично значущою при рівні значущості р<0,05. Для виявлення зв’язку між ознаками застосовували методи кореляційного аналізу: обчислювали коефіцієнт кореляції Пірсона (у разі нормального закону розподілу) або показник рангової кореляції Спірмена л (у разі відмінності закону розподілу від нормального). Розрахунки проводили за допомогою пакета статистичного аналізу МЕДСТАТ.

Результати та їх обговорення

Частота гомозиготного носійства мутації С677Т в гені МТHFR серед жителів Вінницької області становить, за даними літератури, близько 11,0% [3]. Отримані нами результати свідчать, що серед 72 хворих на РГЗ мутації С677Т виявлено у 58,3% пацієнток (гетерозигот СТ — 36,1%, гомозигот ТТ — 22,2%), гомозигот СС (дикий тип) відмічено лише 41,7%. Отже, серед хворих на РГЗ значно переважають особи з генетично-детермінованою схильністю до гіпергомоцистеїнемії.

При проведенні біохімічного аналізу сироватки крові пацієнток з РГЗ середній показник рівня гомоцистеїну становив 12,2±0,25 мкмоль/л (табл. 1). Відзначались значні коливання рівня гомоцистеїну від 7,2 до 16,7 мкмоль/л, при чому гіпергомоцистеїнемія (концентрація вища за 15 мкмоль/л) виявлялася у 15,3% обстежених, що також перевищує поширеність гіпергомоцистеїнемії в популяції Подільського регіону, яка зустрічається у 10% здорових осіб [3]. Гіпергомоцистеїнемія у хворих на РГЗ асоціювалось з носійством Т-алелю: вміст гомоцистеїну у гетерозигот СТ і особливо у гомозигот ТТ достовірно перевищував такий у гомозигот дикого типу (СС) на 9,0 та 33,3% відповідно. Гіпергомоцистеїнемія реєструвалась у 3,3% хворих на РГЗ з генотипом СС і у 50,0% хворих з генотипом ТТ.

Таблиця 1. Вміст гомоцистеїну, маркерів запалення, оксидативного стресу і фіброгенезу у хворих на РГЗ в залежності від генотипу MTHFR (M±m)

Примітка: 1.* — показник є достовірним (р<0,05) по відношенню до групи СС. 2.*# — показник є достовірним (р<0,05) по відношенню до групи СТ.

В сироватці крові пацієнток з РГЗ з різним генотипом МТHFR виявлялись суттєві відмінності у кон­цент­рації профіброгенних факторів ТФР-β1 та оксипроліну – маркера деструкції колагенових білків сполучної тканини (див. табл. 1). Так, у пацієнтів з генотипом СС рівень ТФР-β1 коливався від 112 до 154 пг/мл і в середньому становив 130±1,89 пг/мл. В сироватці крові пацієнтів з генотипом СТ та ТТ він був на 5,4 та 33,1% вищим, ніж у гомозигот СС. Рівень вільного оксипроліну в сироватці крові у гомозигот ТТ також суттєво перевищував такий у гомозигот дикого типу (СС).

При аналізі базальних рівнів маркерів запального процесу -інтерлейкіну-6 (ІЛ-6) та С-реактивного протеїну (СРП) в сироватці крові хворих з РГЗ залежно від генотипу МTHFR були виявлені суттєві відмінності (табл. 1). Так, у гомозигот дикого типу (СС) вміст інтерлейкіну-6 в сироватці крові коливався від 4,32 до 10,2 пг/мл і в середньому становив 7,17±0,23 пг/мл. У носіїв Т-алелю реєструвались достовірно вищі рівні цього прозапального та профіброгенного регулятора: у гетерозигот СТ вміст інтерлейкіну-6 перевищував такий у гомозигот СС на 40,9%, а у гомозигот ТТ – на 78,5%. Подібні міжгрупові відмінності виявлялись і щодо рівня СРП: його вміст у гетерозигот СТ та гомозигот ТТ був вищим на 15,7 та 23,6%, відповідно, ніж у гомозигот дикого типу.

Поліморфізм С677Т гена МТHFR відображався на активності оксидативних процесів у пацієнтів з РГЗ (див. табл. 1). Так, у гомозиготних носіїв мутації (ТТ) вміст маркерів окисної деструкції ліпідів та білків — МДА та карбонільних груп — в сироватці крові перевищував такий у гомозигот дикого типу (СС) на 49,0 та 38,3% відповідно. Більш високі рівні МДА (малоновий діальдегід) та карбонільних груп білків (на 11,3 та 13,6%) реєструвались і у гетерозигот СТ.

Мутації в ММР-12 значно менше вплинули на біохімічні зміни в сироватці крові хворих на РГЗ (див. табл. 2). Так при аналізі вмісту гомоцистеїну достовірних відмінностей між носіями генотипу АА та АG не виявлялось. Слід відзначити, що серед 18 пацієнтів з РГЗ з прогностично більш сприятливим (за даними літератури) щодо ризику пневмофіброзу генотипом AG ММP-12, половина (9 осіб) були носіями алелю Т677 і мали підвищений рівень гомоцистеїну в 33,3% випадків. Середній рівень гомоцистеїну в групі осіб з генотипом АА — носіїв Т-алелю, був дещо меншим, ніж у осіб з генотипом АG, що, очевидно, зумовлено більш високою часткою гетерозигот СТ (57,6%) в цій групі.

Таблиця 2. Вміст гомоцистеїну, маркерів запалення, оксидативного стресу і фіброгенезу у хворих на РГЗ в залежності від генотипу ММП-12 (M±m)

Примітка: 1.* — показник є достовірним (р<0,05) по відношенню до групи ММП-12 АА. 2.# — показник є достовірним (р<0,05) по відношенню до групи ММП-12АG+MTHFR-667Т.

При аналізі маркерів фіброзу залежно від генотипу ММP-12 суттєвих міжгрупових відмінностей не виявляли, за винятком більш високого вмісту оксипроліну в сироватці крові у осіб з генотипом АG — носіїв алелю Т667.

При аналізі вмісту прозапальних маркерів і маркерів оксидативного стресу в сироватці крові залежно від генотипу ММP-12 достовірних відмінностей не виявлено. Зауважимо, що вміст ІЛ-6 та СРП у носіїв генотипів АG + МТНFR-667Т та АА + МТHFR-667Т також був зіставним.

Ранжирування рівня гомоцистеїну показало, що збільшення базальних рівнів профіброгенних та прозапальних медіаторів в сироватці крові пацієнтів з РГЗ асоціюється з розвитком гіпергомоцистеїнемії (табл. 3). Зокрема, вміст ТФР-β₁, ІЛ-6, СРП у пацієнтів з РГЗ без гіпергомоцистеїнемії був достовірно нижчим на 16,6, 40,0 та 23,4%, ніж у пацієнтів з високим рівнем гомоцистеїну. Відповідно у пацієнтів з гіпергомоцистеїнемією вміст вільного оксипроліну, маркерів пероксидацїї ліпідів та білків також був вищим, ніж у пацієнтів з нормогомоцистеїнемією. Виявлені закономірності підтвердили і результати кореляційного аналізу: тісні зв’язки виявляли між вмістом гомоцистеїну з одного боку та рівнем ТФР-β₁, ІЛ-6, маркерів оксидативного стресу — з іншого.

Таблиця 3. Вміст біохімічних маркерів в сироватці крові пацієнтів з РГЗ (n=72) в залежності від ранжирування рівня ГЦ (M±m)

Таким чином, поширеність мутації гена С677Т МТHFR у пацієнтів з РГЗ є вищою, ніж у загальній популяції. Вказаний поліморфізм детермінує відмінності не лише у базальному рівні гомоцистеїну в сироватці крові, а й у вмісті вагомих регуляторів фібротичних та запальних процесів — ТФР-β₁, ІЛ-6.

Більш високий рівень профіброгенних та прозапальних медіаторів може детермінувати підвищену схильність до розвитку гіперкогуаляторних, судинних і склеротичних процесів, особливо після проведення хіміо- та променевої терапії. У таких хворих підвищений ризик розвитку тромбоемболій, кардіосклерозу, пневмо- і гепатофіброзу.

Поліморфізм в гені ММP-12 не асоціюється з гіпергомоцистеїнемією та системними змінами вмісту ТФР-β₁, ІЛ-6, СРП, маркерів оксидативного стресу в сироватці крові, але в поєднанні з мутацією С677Т MTHFR посилює її негативний вплив.

Висновки

1. Поліморфізм гена С677Т MTHFR у хворих на РГЗ виявляють в 5 разів частіше, ніж в загальній популяції осіб Подільського регіону, що приводить до збільшення кількості осіб з генетично-детермінованою схильністю до гіпергомоцистеїнемії, особливо при гомозиготному Т/Т генотипі.

2. Гіпергомоцистеїнемія тісно корелює з маркерами запалення, фіброгенезу та оксидативного стресу (ТФР-β_l, г=0,66; ІЛ-6, г=0,64; оксипроліну, г=0,54; МДА, г= 0,70; карбонільних груп білків г=0,61), що може бути прогностично несприятливим фактором в лікуванні хворих на РГЗ.

Вивчення впливу вищезгаданих факторів на прогноз перебігу та лікування РГЗ є перспективним напрямком для подальших наукових досліджень.

Література

1. Дидковский H.A., Жарова М.А. (2005) Наследственные факторы при болезнях органов дыхания. Пульмонология, 4: 53–60.

2. Кулікова H.A., Ковальчук Л.Є. (2004) Медична генетика. Тернопіль: Укрмедкнига. 188 с.

3. Пентюк О.О., Луцюк М.Б., Заічко Н.В. та ін. (2008) Патогенетичні аспекти гіпергомоцистеїнемії та перспективи створення лікарських засобів для лікування патології, асоційованої з порушеннями обміну гомоцистеїну. Biomedical and Biosocial Anthropology, 10: 297–303.

4. Пентюк H.O. (2011) Метаболічні предиктори фіброзу печінки у хворих на хронічні гепатити. Експериментальна та клінічна медицина, 1: 134–138.

5. Путинцева Г.Й. (2008) Медична генетика. К.: Медицина. 392 с.

6. Федота О.М., Рижко П.П., Рощенюк Л.В. та ін. (2010) Поліморфізм С677Т гена MTHFR у хворих на псоріаз. Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна, 920: 37–41.

7. Хурані І.Ф. (2011) Вплив кверцетину та тіотріазоліну на хіміопроменеве пошкодження легень у щурів різних генетичних ліній. Фармакологія та лікарська токсикологія, 3: 57–63.

8. Черняев А.Л., Самсонова М.В. (2011) Воспаление при хронической обструктивной болезни легких. Consilium Medicum Ukraine, 1: 9–14.

9. Fernandez-Peralta A.M., Daimiel L., Nejda N. et al. (2010) Association of polymorphisms MTHFR C677T and A1298C with risk of colorectal cancer, genetic and epigenetic characteristic of tumors, and response to chemotherapy. Int. j. colorectal dis., 25(2): 141–51.

10. Kang H., Cho S., Lee C. et al. (2007) Transforming growth factor (TGF)-betal stimulates pulmonary fibrosis and inflammation via a Bax-dependent, bid-activated pathway that involves matrix metalloproteinase-12. J. boil. chem., 282(10): 7723–7732.

11. Laurent G.L., Bates P.C. Sparrow M.C. et al. (1978) Muscle protein turnover in the adult fowl, 3:collagen content and turnover in cardiac and skeletal muscules in the adult fowl (Gallus domesticus) and the changes during stretch-induced growth. Biohemj., 176: 419–427.

12. Lu M., Wang F. Qiu J. (2010) Methionine synthase A2756G polymorphism and breast cancer risk: a meta-analysis involving 18,953 subjects. Breast. Cancer. Res. Treat., 123(1): 213–217.

13. Mac Dougall J.R., Matrisian L.M. (1995) Contributions of tumor and stromal matrix metalloprotemases to tumor progression, invasion and metastasis. Cancer metastasis. rev., 14(4): 351–362.

14. Manetti M., Ibba-Manneschi L., Fatini C. et al. (2010) Association of a functional polymorphism in the matrix metalloproteinase-12 promoter region with systemic sclerosis in an Italian population. J. rheumatol., 37 (9): 1852–1857.

15. Raaf L., Nol C., Cherifi M. et al. (2011) Myocardial fibrosis and TGFB expression in hyperhomocysteinemic rats. Mol. cell. biochem., 3447(1–2): 63–70.

16. Toffoli G., Russo A., Innocenti F. et al. (2003) Effect of methylenetetrahydrofolate reductase 677C~>T polymorphism on toxicity and homocysteine plasma level after chronic methotrexate treatment of ovarian cancer patients. Int. j. cancer., 103( 3): 294–299.

Коментарів немає » Додати свій

Leave a comment

Ім’я (required)

Mail (will not be published) (required)

Сайт

CAPTCHA Code