Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) характеризуется выраженной гетерогенностью клинического течения. Особенно неблагоприятный прогноз ассоциирован с инактивацией опухолевого супрессора p53 в результате делеции 17p13 (область локализации гена TP53) и/или точковых мутаций в нуклеотидной последовательности гена [1, 2]. Белок p53 функционирует как транскрипционный фактор и является главным регулятором клеточного ответа на действие генотоксических факторов, индуцируя апоптоз или остановку клеточного цикла и репарацию ДНК. Нормальное функционирование p53 критически важно для предотвращения накопления мутаций, способствующих злокачественной трансформации и прогрессированию трансформированных клонов, а также для опосредования действия химиотерапевтических препаратов [3].

Активность р53 в клетке регулируется на посттрансляционном уровне продуктами многих генов, при этом основным негативным регулятором является белок Mdm2 (Murine double minute-2) [4]. Mdm2 взаимодействует с р53 по принципу обратной негативной связи: p53 активирует экспрессию белка Mdm2, действуя как транскрипционный фактор для MDM2 гена. В свою очередь, Mdm2 обеспечивает снижение уровня р53, индуцируя его убиквитинзависимую деградацию. При этом Mdm2 функционирует как специфичная для p53 E3 убиквитин-лигаза — катализирует присоединение остатков убиквитина, что приводит к перемещению р53 в цитоплазму и последующей его деградации в протеасомах. Кроме того, Mdm2 подавляет транскрипционную активность белка р53 относительно генов-мишеней, связывая его N-терминальный трансактивационный домен и блокируя взаимодействие с другими факторами транскрипционного аппарата, в частности TFIIE и CBP/p300 [5]. Взаимная регуляция в паре р53 — Mdm2 позволяет ограничивать продолжительность и интенсивность p53-зависимого ответа на действие генотоксических факторов, а также обеспечивает низкий уровень p53 в нормальных клетках. Избыточная экспрессия белка Mdm2, как показали исследования, может приводить к существенной дисфункции p53 [6, 7].

Хорошо известен функционально значимый однонуклеотидный полиморфизм (SNP) в промоторной области гена MDM2, влияющий на уровень его экспрессии, — замена T на G в позиции 309 1-го интрона (SNP309 T>G, rs2279744). SNP309 G аллель характеризуется более высокой аффинностью к транскрипционному фактору Sp1 (stimulatory protein 1) по сравнению с Т вариантом, что определяет высший уровень экспрессии гена MDM2, соответствующего белка, а также сниженную активность p53 в клетке [8].

Первым исследованием ассоциаций полиморфизма SNP309 с течением ХЛЛ была работа I. Gryshchenko и соавторов [9]. Ученые выявили сокращение периода общей выживаемости (ОВ) больных с генотипом TG (р=0,02) и GG (р=0,001) по сравнению с носителями генотипа ТТ. Аналогичные данные были получены K. Willander и соавторами [10]. Продемонстрировано также, что данный полиморфизм является маркером эффективности ответа пациентов на применение специфического ингибитора Mdm2 — нутлина-3а [11]. Вместе с тем многие авторы не выявили существенного прогностического значения SNP309 генотипов для оценки течения ХЛЛ [12–14]. В этой связи прогностическое значение SNP309 нельзя считать окончательно установленным.

Целью настоящей работы являлось определение значения полиморфизма SNP309 гена MDM2 для оценки клинических особенностей ХЛЛ и прогноза течения заболевания.

Объект и методы исследования

Исследование проведено в группе 224 первичных больных ХЛЛ, которая включала 171 (76,3%) мужчину и 53 (23,7%) женщины в возрасте 29–80 лет (средний возраст 57,9±0,64 года, медиана 58 лет). Пациенты находились на лечении в отделении гематологии ГУ «Национальный научный центр радиационной медицины НАМН Украины». Проведение исследования было одобрено комитетом по медицинской этике центра.

Диагноз ХЛЛ устанавливали на основании клинико-гематологических критериев и иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови. Стадию ХЛЛ определяли согласно классификациям K.R. Rai и соавторов [15, 16], а также J.L. Binet и соавторов [17]. По классификации Binet 114 больных (50,9%) находились на ранней стадии заболевания А, 81 пациент (36,2%) — на стадии В (развернутая) и 29 больных (12,9%) — на стадии С. Согласно классификации Rai распределение больных по стадиям ХЛЛ было следующим: стадия 0 — 30 больных (13,4%), стадия І — 81 (36,2%), стадия ІІ — 82 (36,6%), стадия ІІІ — 19 (8,5%) и стадия IV — 12 (5,4%).

Геномную ДНК выделяли из мононуклеаров периферической крови с использованием наборов QIAamp Blood Mini Kit (Qiagen). Генотипирование полиморфизма SNP309 T>G гена MDM2 проводили методом полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ), как было предложено H. Hirata и соавторами [18], с небольшими модификациями. ПЦР проводили с 50 нг ДНК в конечном объеме 20 мкл реакционной смеси, содержащей прямой (5′-CGCGGGAGTTCAGGGTAAAG-3′) и обратный (5′-CTGAGTCAACCTG CCCACTG-3′) праймеры (0,4 мкмоль каждого) и 10 мкл PCR Master Mix (2X) (Fermentas). Режим ПЦР был следующим: начальная денатурация — 95 °C, 3 мин, затем 35 циклов амплификации (95 °C — 30 с, 57 °C — 30 с, 72 °C — 30 с). Для рестрикционного анализа ПЦР продукты обрабатывали эндонуклеазой рестрикции MspA1I (Promega), следуя рекомендациям производителя. Продукты рестрикции/амплификации анализировали посредством электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия (рис. 1). В случае наличия SNP309 G аллели ПЦР продукт (157 п.н.) имел сайт рестрикции для MspA1I (образование фрагментов 109 п.н. и 48 п.н.), при наличии SNP309 Т аллели данный сайт рестрикции отсутствовал.

В качестве прогностических маркеров у всех больных был определен мутационный статус генов вариабельных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов (IGHV), как описано ранее [19], а также исследовали мутации гена ТР53 в области экзонов 3–10 методом прямого секвенирования. Использованные праймеры, а также детали проведения ПЦР для выявления мутаций гена ТР53 доступны по запросу. Анализ мутаций ТР53 проводили с помощью базы данных International Agency for Research on Cancer (IARC) TP53 Mutation Database (http://www.p53.iarc.fr).

В зависимости от генотипов SNP309 гена MDM2 оценивали следующие параметры: клинико-гематологические данные при установлении диагноза, развитие осложнений (аутоиммунной гемолитической анемии, вторичных опухолей, трансформации Рихтера), время до необходимости начала терапии, выживаемость без прогрессирования заболевания (ВБП) и ОВ пациентов. Для оценки времени до необходимости начала терапии, ВБП и ОВ применяли метод Каплана — Мейе­ра, а также уни- и мультивариантный Кокс-регрессионный анализ. В число факторов, помимо генотипов SNP309 гена MDM2, включали: стадию заболевания по Binet, мутационный статус IGHV генов, инициальный лейкоцитоз (граничный уровень 70 Г/л), возраст пациента при установлении диагноза (граничный возраст 65 лет), наличие или отсутствие мутаций гена ТР53. Медиана наблюдения пациентов составила 53 мес.

Результаты исследования

В обследованной группе первичных больных ХЛЛ преобладали пациенты с немутированным статусом IGHV генов (64,3%) и отсутствием мутаций гена ТР53 (97,3%).

Частота генотипов SNP309 гена MDM2 в группе обследованных была следующей: ТТ — 110 (49,1%) пациентов, TG — 93 (41,5%) пациента, GG — 21 (9,4%) пациент. Распределение SNP309 генотипов соответствовало уравнению Харди — Вайнберга (χ²=0,04) и существенно не отличалось от распределения в других европейских когортах пациентов с ХЛЛ [14].

Клинико-гематологические данные при установлении диагноза ХЛЛ, а также частота вторичных осложнений достоверно не различались у носителей отдельных генотипов SNP309 гена MDM2 (табл. 1). В процессе наблюдения 168 (75,0%) больным назначена специфическая терапия (31 — на основе пуриновых аналогов, 137 — алкилирующими препаратами). Время до начала терапии статистически значимо не различалось у носителей отдельных генотипов, медиана составила 25 мес при генотипе ТТ, 22 мес — при ТG и 6 мес — при GG (р=0,109 при сравнении всех генотипов и р=0,064 при сравнении генотипа GG и генотипов ТТ + ТG).
Таблица 1. Клинико-гематологические данные больных ХЛЛ при установлении диагноза в зависимости от генотипов SNP309 гена MDM2

Скорость прогрессирования заболевания была выше у носителей генотипа GG. Медиана ВБП составила: 79 мес при генотипе ТТ, 56 мес — при ТG и 48 мес — при GG (р=0,028 при сравнении всех генотипов и р=0,037 при сравнении генотипа GG и генотипов ТТ + ТG). Однако при комплексном учете других маркеров прогноза вклад полиморфизма SNP309 гена MDM2 оказался незначимым (табл. 2). Только в подгруппе пациентов с отсутствием мутаций ТР53 и немутированным статусом IGHV генов вклад полиморфизма был значимым. Медиана ВБП составила: 49 мес при генотипе ТТ, 48 мес — при ТG и 24 мес — при GG (р=0,044 при сравнении всех генотипов и р=0,013 при сравнении генотипа GG и генотипов ТТ + ТG).

Таблица 2. Прогностическая значимость отдельных маркеров при анализе ОВ и ВБП обследован­ных больных ХЛЛ

Аналогичную картину отмечали при анализе ОВ пациентов: несмотря на то, как изолированный фактор полиморфизм SNP309 гена MDM2 влиял на длительность ОВ (медиана ОВ составила 114 мес при генотипе ТТ, 98 мес — при ТG и 61 мес — при GG; р=0,018 при сравнении всех генотипов и р=0,008 при сравнении генотипа GG и генотипов ТТ + ТG), с учетом других факторов прогноза его значимость сохранялась лишь в подгруппе пациентов с отсутствием мутаций ТР53 и немутированным статусом IGHV генов. Для этих пациентов медиана ОВ составляла 79 мес при генотипе ТТ, 68 мес — при ТG и 43 мес — при генотипе GG; р=0,014 при сравнении всех генотипов и р=0,004 при сравнении генотипа GG и генотипов ТТ + ТG (рис. 2).

Обсуждение полученных результатов

При анализе всей когорты обследованных больных ХЛЛ мы не выявили влияния полиморфизма SNP309 гена MDM2 на клинико-гематологические данные при установлении диагноза, развитие вторичных осложнений и выживаемость в комплексе с другими факторами прогноза. В то же время полученные результаты свидетельствуют о наличии ассоциации генотипа SNP309 GG с неблагоприятным течением ХЛЛ в группе первичных пациентов с отсутствием мутаций гена ТР53 и немутированным статусом IGHV генов (62,5% от числа всех обследованных больных), что выражалось в более быстром прогрессировании заболевания и меньшей выживаемости таких больных. Это подтверждает мнение многих авторов о возможности использования полиморфизма SNP309 гена MDM2 в качестве маркера прогноза заболевания [10–12]. Объяснением подобного влияния, как принято считать, является более слабая активность p53, связанная с повышенным уровнем экспрессии белка Mdm2 у носителей SNP309 GG генотипа [9–11]. Следует отметить также снижение уровня экспрессии микроРНК ­miR-34a, которое ранее было выявлено у носителей генотипа SNP309 GG по сравнению с носителями генотипа SNP309 ТТ [20, 21]. miR-34a способна связываться с нуклеотидной последовательностью генов-мишеней и регулировать их экспрессию. В частности, экспрессия miR-34a негативно коррелирует с экспрессией антиапоптотического гена Bcl2 и позитивно — с более низкой пролиферативной активностью лейкемических клеток при ХЛЛ, более длительным периодом удвоения содержания лейкоцитов и более длительным периодом до необходимости начала терапии [20–22].

Нам представляется возможным еще один механизм реализации влияния полиморфизма SNP309 на течение ХЛЛ. Недавно продемонстрировано, что Mdm2 действует как кофактор для NF-κB — транскрипционного фактора, опосредующего пролиферативные и антиапоптотические сигналы в клетке [23]. Показано, что NF-κB аберрантно активирован при ХЛЛ, при этом высокий уровень активности ассоциирован с резистентностью к химиотерапии и неблагоприятным течением заболевания [24, 25]. Можно предположить, что избыточная экпрессия Mdm2 при SNP309 GG генотипе усиливает NF-κB активность, что приводит к повышению пролиферативных свойств лейкозных клеток и снижению их чувствительности к действию проапоптотических стимулов. Для подтверждения данного предположения необходимы дальнейшие исследования.

Благодарность

Мы выражаем ­благодарность г-ну Т. Хармсу, ­президенту благотворительной организации «KiHev — Kinderhilfe Kiew e.V.» за поддержку в обеспечении реактивами.

Список использованной литературы

1. Dohner H., Fischer K., Bentz M. et al. (1995) p53 gene deletion predicts for poor survival and non-response to therapy with purine analogs in chronic B-cell leukemias. Blood, 85(6): 1580–1589.

2. Rossi D., Cerri M., Deambrogi C. et al. (2009) The prognostic value of TP53 mutations in chronic lymphocytic leukemia is independent of del17p13: implications for overall survival and chemorefractoriness. Clin. Cancer Res., 15(3): 995–1004.

3. Haupt S., Haupt Y. (2006) Importance of p53 for cancer onset and therapy. Anticancer Drugs, 17(7): 725–732.

4. Momand J., Zambetti G.P., Olson D.C. et al. (1992) The mdm-2 oncogene product forms a complex with the p53 protein and inhibits p53-mediated transactivation. Cell, 69(7): 1237–1245.

5. Shi D., Gu W. (2012) Dual roles of MDM2 in the re­gulation of p53: ubiquitination dependent and ubiquitination independent mechanisms of MDM2 repression of p53 activity. Genes. Cancer, 3(3–4): 240–248.

6. Poyurovsky M.V., Prives C. (2006) Unleashing the power of p53: Lessons from mice and men. Genes Develop., 20(2): 125–131.

7. Grochola L.F., Zeron-Medina J., Meriaux S., Bond G.L. (2010) Single-nucleotide polymorphisms in the p53 signaling pathway. Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2(5): a001032: 1–18.

8. Bond G.L., Hu W., Bond E.E. et al. (2004) A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans. Cell, 119 (5): 591–602.

9. Gryshchenko I., Hofbauer S., Stoecher M. et al. (2008) MDM2 SNP309 is associated with poor outcome in B-cell chronic lymphocytic leukemia. J. Clin. Oncol., 26(14): 2252–2257.

10. Willander K., Ungerback J., Karlsson K. et al. (2010) MDM2 SNP309 promoter polymorphism, an independent prognostic factor in chronic lymphocytic leukemia. Eur. J. Haematol., 85(3): 251–256.

11. Seyfried I., Hofbauer S., Stoecher M. et al. (2008) SNP309 as predictor for sensitivity of CLL cells to the MDM2 inhibitor nutlin-3a. Blood, 112(5): 2168.

12. Kaderi M.A., Mansouri M., Zainuddin N. et al. (2010) Lack of association between the MDM2 promoter polymorphism SNP309 and clinical outcome in chronic lymphocytic leukemia. Leuk. Res., 34(3): 335–339.

13. Zenz T., Habe S., Benner A. et al. (2008) The MDM2 — 309 T/G promotor single nucleotide polymorphism does not alter disease characteristics in chronic lymphocytic leukemia. Haematologica, 93 (7): 1111–1113.

14. Benner A., Mansouri L., Rossi D. et al. (2014) MDM2 promotor polymorphism and disease characte­ristics in chronic lymphocytic leukemia: results of an individual patient data-based meta-analysis. Haematologica, 99(8): 1285–1291.

15. Rai K.R., Sawitzky A., Cronkite E.P. (1975) Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood, 46(2): 219–234.

16. Rai K.R. (1987) A critical analysis of staging in CLL. Chronic lymphocytic leukemia. Recent progress and future direction. New York: Alan. R. Liss. 253 p.

17. Binet J.L., Auguier A., Dighiero G. et al. (1981) A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariante survival analysis. Cancer, 48(1): 198–205.

18. Hirata H., Hinoda Y., Kikuno N. et al. (2007) MDM2 SNP309 polymorphism as risk factor for susceptibility and poor prognosis in renal cell carcinoma. Clin. Cancer Res., 13(14): 4123–4129.

19. Abramenko I., Bilous N., Chumak A. et al. (2008) Chronic lymphocytic leukemia patients exposed to ionizing radiation due to the Chernobyl NPP accident — with focus on immunoglobulin heavy chain gene analysis. Leuk. Res., 32(4): 535–542.

20. Asslaber D., Pinon J.D., Seyfried I. et al. (2010) microRNA-34a expression correlates with MDM2 SNP309 polymorphism and treatment-free survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood, 115(21): 4191–4297.

21. Merkel O., Asslaber D., Pinon J.D. et al. (2010) Interdependent regulation of p53 and ­miR-34a in chronic lymphocytic leukemia. Cell Cycle, 9(14): 2764–2768.

22. Zauh G., Voltan R., di Iasio M.G. et al. (2011) miR-34a induces the downregulation of both E2F1 and B-Myb oncogenes in leukemic cells. Clin. Cancer Res., 17(9): 2712–2724.

23. Mulay S.R., Thomasova D., Ryu M., Anders H.J. (2012) MDM2 (murine double minute-2) links inflammation and tubular cell healing during acute kidney injury in mice. Kidney Int., 81: 1199–1211.

24. Liu Z., Hazan-Halevy I., Harris D.M. et al. (2011) Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 activates nuclear factor (NF)-κB in chronic lymphocytic leukemia cells. Mol. Cancer Res., 9(4): 507–515.

25. Kanduri M., Tobin G.,Aleskog A. et al. (2011) The novel NF-jB inhibitor IMD-0354 induces apoptosis in chronic lymphocytic. Blood Cancer J., 1(3): e12: 1–6.

Адрес:
Белоус Надежда Ивановна
04050, Киев, просп. Победы, 119/121
ГУ «Национальный научный центр
радиационной медицины НАМН Украины»
Факс: (044) 483-06-37
E-mail: nbilous@yahoo.com

Коментарів немає » Додати свій

Leave a comment

Ім’я (required)

Mail (will not be published) (required)

Сайт

CAPTCHA Code