Локальна імунна відповідь у хворих на меланому шкіри: зв’язок з ефективністю інтерферонотерапії

Резюме. При помощи иммуногистохимического метода изучены фенотипические особенности лимфоцитов, инфильтрирующих первичную меланому кожи, у 12 пациентов с  IB–IIC стадией заболевания. Показано, что клетки воспалительного инфильтрата экспрессируют CD3-, CD8-, CD45RA-, CD45RO- и CD20-антигены. Во всех случаях клетки лимфоидного инфильтрата в строме и паренхиме были представлены Т-лимфоцитами (CD3+) и только в 3 из 12 случаев, помимо CD3+-клеток, выявлены В-лимфоциты (CD20+). Все Т-лимфоциты экспрессировали исключительно корецептор CD8, что позволило отнести их к субпопуляции цитотоксических Т-лимфоцитов. Большинство цитотоксических Т-лимфоцитов локализовались в строме опухоли и были представлены как наивными Т-клетками (CD45RA+), так и клетками иммунологической памяти (CD45RO+). При ретроспективном анализе, проведенном в зависимости от эффективности адъювантной интерферонотерапии (ИФН-терапии), установлено, что у больных с благоприятным течением заболевания, в отличие от пациентов с рецидивом меланомы кожи, развившимся у 4 из 12 пациентов в течение первого года после иссечения первичной опухоли, регистрируется более выраженная инфильтрация стромы опухоли CD45RO+-клетками, а паренхимы — CD8+-лимфоцитами. Полученные результаты открывают новые возможности применения иммунологических параметров в прогнозировании ответа на ИФН-терапию у больных первично-локализованной меланомой кожи.

Введение

Предположения о ведущей роли иммунологических механизмов в регрессии меланомы кожи, косвенным свидетельством которых является выраженная лимфоидно-клеточная инфильтрация первичной опухоли, ученые высказывали достаточно давно [1–3]. В частности, показано, что рецидив заболевания реже развивается у пациентов с выраженной местной лимфоидно-плазмоцитарной реакцией в строме опухоли, выявляемой в 37% случаев первично-локализованной меланомы кожи [2]. В исследовании C.G. Clemente и соавторов [3], проведенном на большом клиническом материале, установлено, что лимфоидно-клеточная инфильтрация первичной меланомы кожи является независимым благоприятным прогностическим фактором.

В настоящее время признано, что доминирующая клеточная популяция воспалительного инфильтрата в строме меланомы кожи представлена Т-лимфоцитами, и наличие CD8-клеток в ее паренхиме является важным прогностическим критерием лучшей выживаемости больных [4]. Однако является ли этот факт свидетельством элиминации опухолевых клеток или признаком торможения роста опухоли — вопрос дискуссионный.

В дальнейшем продемонстрировано, что не только первичная опухоль, но и вторичные метастатические поражения несут свидетельства иммунологического контроля их роста. На основании анализа транскрипционного профиля генов врожденного и адаптивного иммунного ответа удалось выделить варианты метастазов меланомы кожи с иммунологически активным и неактивным («бессимптомным») фенотипами [5–7].

Исследование биоптатов метастатических поражений у этих больных в динамике иммунотерапии показало переход профиля транскрипционных факторов от иммунологически неактивного к активному [6]. Авторы цитируемой работы высказали предположение, что на поздних стадиях заболевания экспрессия дифференцировочных антигенов меланомы обусловлена активацией иммуносвязанных транскрипционных факторов, поддерживающих дедифференцировку опухолевых клеток [7]. Выявление интерферон-регулирующего фактора 1 (IRF-1) в этих образцах коррелировало с лучшей выживаемостью больных [8, 9]. Кроме того, в опухолях пациентов, ответивших на иммунотерапию, выявлены признаки развития выраженной воспалительной реакции на фоне активации интерферон-стимулирующих генов (ISGs) и индукции γ-интерферона (γ-ИФН). Привлечение Т-лимфоцитов в очаг воспаления обусло­влено продукцией хемокинов, что, в свою очередь, коррелирует с интенсивной инфильтрацией паренхимы опухоли CD8 Т-лимфоцитами [10].

Таким образом, по мнению большинства исследователей, лимфоидно-клеточная инфильтрация и/или индукция транскрипционных факторов генов иммунного ответа свидетельствует об активации противоопухолевой иммунной защиты, что коррелирует с благоприятным прогнозом у больных меланомой кожи.

Этим аспектам взаимоотношений опухоли и организма с учетом системных иммунных реакций в настоящее время уделяется особое внимание, что связано с полученными данными о прогностической ценности различных иммунологических параметров у больных злокачественными новообразованиями и разработкой стандартизованных подходов к их определению [11–13]. В связи с этим обсуждается возможность включения иммунологических критериев в параметры стадирования онкологических заболеваний [14, 15] и применения в ряде случаев иммуно­зависимых критериев (irRC) при оценке результатов иммунотерапии [14].

Статья посвящена изучению при помощи иммуногистохимического (ИГХ) метода локализации лимфоцитов, их фенотипических характеристик и выраженности инфильтрации ткани первичной опухоли с целью уточнения прогностической ценности этих показателей при проведении адъювантной ИФН-терапии у больных первично-локализованной меланомой кожи.

Объект и методы исследования

В исследование включено 12 больных меланомой кожи ІВ–ІІС стадии (средний возраст 57,7±3,7 года), находившихся на лечении в отделении опухолей кожи и мягких тканей Национального института рака в 2009–2012 гг. Пациенты получали стандартную терапию, включающую хирургическое лечение (широкое иссечение первичной опухоли) и адъювантную α-ИФН-терапию (α-2b-ИФН подкожно по 3 млн МЕ 3 раза в неделю в течение 12 мес). Возникновение рецидива на протяжении первого года после удаления первичной опухоли расценивали в данном исследовании как неблагоприятное течение заболевания, соответственно, отсутствие рецидива — как благоприятное. Все больные дали информированное согласие на участие в исследовании, одобренное локальной Комиссией по вопросам этики.

Характеристика больных в зависимости от пола, возраста, локализации и патогистологических особенностей первичной меланомы (средняя толщина опухоли по Breslow 3,1±0,4 мм) с учетом течения заболевания представлена в таблице.

Таблица. Характеристика больных

ИГХ исследование первичной опухоли проведено на материале, полученном при хирургическом лечении больных. Операционный материал фиксировали в забуференном 10% растворе формалина (pH 7,4) и уплотняли в парапласт с применением гистиопроцессора Histos-5 («Milestone», Италия). Из парафиновых блоков изготовляли гистологические срезы толщиной 5 мкм с помощью микротома Microm НМ325 («Thermo Scientific», Германия). Для общей оценки новообразований срезы окрашивали гематоксилином и эози­ном.

ИГХ реакции проводили с антителами против антигенов человека: поликлональным CD3, моноклональными CD8 (сlone C8/144B), CD4 (сlone 4B12), CD20cy (сlone L26), CD56 (сlone 123C3), CD45RO (сlone UCHL1) («Dako», Дания) в соответствии с рекомендациями производителя, а также CD45RA (сlone ALB11) («Beckman Coulter», США), HLA-DR (сlone G46-6 (L243)), CD25 (сlone M-A251), CD95 (сlone DX2) («Becton Dickinson», США).

Для визуализации продуктов ИГХ реакции применяли систему детекции EnVision™ FLEX («Dako», Дания) с использованием в качестве хромогена 3-амино-9-этилкарбазола (Mono AEC; «DBS», США). Срезы докрашивали гематоксилином Gill. В качестве положительного контроля использовали тканевые образцы с определенной положительной реактивностью, а для отрицательного контроля проводили процедуру без применения первичных антител.

Полученные препараты изучали и фотографировали при помощи микроскопа Nikon Eclipse 80i с камерой DS-5SMc/L2. Оценку содержания меченых клеток в препаратах производили полуколичественно: «0» — отсутствие, «1+» — единичные клетки, «2+» — 10–30 клеток, «3+» — более 30 клеток в поле зрения,  выражая результаты в условных единицах от 0 до 3.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программ Excel (MS Office 2003, XP) и Statіstіca 6.0 («StatSoft Inc.», США). Результаты исследования представляли в виде медианы с минимальным и максимальным значениями. Для определения достоверности различий показателей в группах использовали критерий Манна — Уитни. Различия оценивали как достоверные при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Среди изученных лейкоцитарных антигенов (CD3, CD8, CD4, CD20, CD56, CD45RA, CD45RO, CD95, CD25, HLA-DR) в процессе ИГХ выявления признаков иммунного воспаления в ткани первичной меланомы кожи была подтверждена экспрессия только пяти (CD3, CD8, CD45RA, CD45RO, CD20) (рис. 1).

Как свидетельствуют данные рис. 1, во всех случаях клетки лимфоидного инфильтрата в строме и паренхиме меланомы были представлены Т-лимфоцитами (CD3) и только у 3 из 12 пациентов, помимо CD3-клеток, выявлены В-лимфоциты (CD20). Кроме того, все Т-лимфоциты экспрессировали исключительно корецептор CD8, что позволило отнести эти клетки к субпопуляции цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ). Большинство ЦТЛ локализовались в строме опухоли (соответственно 2,10 (1,25; 2,50) против 0,62 (0; 1,40) усл. ед. в ее паренхиме; p<0,05). При этом инфильтрация паренхимы меланомы CD8-лимфоцитами выявлена у 9 из 12 пациентов.

Субпопуляция CD8 Т-лимфоцитов была представлена как наивными Т-клетками, экспрессирующими изоформу тирозинфосфатазы CD45RA, так и клетками иммунологической памяти (CD45RO). При детальном анализе оказалось, что в строме опухоли во всех изученных случаях присутствуют и наивные CD8-лимфоциты, и клетки иммунологической памяти (соответственно 2,28 (1,33; 2,88) и 2,00 (1,67; 2,86) усл. ед.).

Напротив, паренхима меланомы в 8 из 12 случаев инфильтрирована CD45RA-лимфоцитами, тогда как CD45RO-клетки выявлены только у 4 из 12 пациентов (соответственно 0,57 (0; 2,00) и 0 (0; 1,00) усл. ед). Важно то, что в этих 4 случаях отмечены как CD45RA-, так и CD45RO-клетки, что не исключает экспрессию обеих изоформ тирозинфосфатазы на CD8 Т-лимфоцитах иммунного воспаления при первичной меланоме кожи.

Полученные результаты не противоречат ранее описанным данным [3, 6, 9], свидетельствующим о преобладании CD8-лимфоцитов среди клеток лимфоидного инфильтрата в ткани первичной меланомы кожи. Идентификация фенотипических различий этих клеток позволяет предположить, что формирование местных противоопухолевых иммунных реакций может происходить не только за счет активации наивных ЦТЛ в микроокружении опухоли с последующей инфильтрацией ее паренхимы, но и генерации меланома­специфических ЦТЛ из эффекторных Т-клеток иммунологической памяти.

В настоящее время инфильтрация первичной опухоли CD845RO-лимфоцитами рассматривается при некоторых злокачественных новообразованиях как один из важнейших прогностических признаков, ассоциированный с благоприятным течением заболевания [8, 9, 13].

Нами проведен ретроспективный анализ экспрессии наиболее информативных лейкоцитарных антигенов, описанных выше, в ткани первичной меланомы кожи в зависимости от эффективности ИФН-терапии в адъювантном режиме у этих больных. Учитывая, что в условиях применения α-ИФН в течение первого года после иссечения первичной меланомы кожи прогрессирование заболевания зарегистрировано у 4 из 12 пациентов, для анализа данных сформированы две группы — с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания (рис. 2).

Как видно из данных, представленных на рис. 2, интенсивность инфильтрации (суммарная доля окрашенных клеток в строме и паренхиме опухоли) первичной меланомы кожи различными популяциями лимфоцитов (CD3-, CD8-, CD45RA-, CD45RO- и CD20-клетками) у пациентов с благоприятным и неблагоприятным течением заболевания на фоне ИФН-терапии существенно не отличается (p>0,05).

Обращает внимание выраженная тенденция к увеличению доли CD8- и CD45RA-клеток в воспалительном инфильтрате у больных с благоприятным течением заболевания (рис. 3), а также малая доля и, соответственно, низкая информативность выявления В-лимфоцитов в контексте их прогностической ценности при первичной меланоме кожи.

Поэтому проведен анализ субпопуляционного состава Т-лимфоцитов, инфильтрирующих отдельно строму или паренхиму первичной опухоли. Оказалось, что у больных с благоприятным течением заболевания, в отличие от пациентов с прогрессированием меланомы кожи более выражена инфильтрация стромы опухоли CD45RO-клетками (соответственно 2,10 (1,67; 2,86) и 1,85 (1,67; 2,00) усл. ед.; p<0,05), а паренхимы — CD8-лимфоцитами (соответственно 1,0 (0; 1,4) и 0,07 (0; 0,57) усл. ед.; p<0,05).

Эти результаты свидетельствуют о том, что увеличение доли ЦТЛ и/или эффекторных Т-клеток памяти среди лимфоцитов иммунного ­воспаления у больных первично-локализованной меланомой кожи связано с благоприятным течением заболевания на фоне адъювантной ИФН-терапии.

Можно предположить, что клетки иммунологической памяти, сенсибилизированные к антигенам меланомы на ранних стадиях опухолевого роста, способны формировать местный противоопухолевый иммунный ответ, играющий ключевую роль в предотвращении рецидива заболевания. Клиническое значение иммунологического феномена накопления CD8- и CD45RO-клеток в ткани опухоли установлено ранее при других злокачественных новообразованиях [9, 13, 16].

С другой стороны, известно, что подавление противоопухолевых функций у ЦТЛ одного клона в микроокружении опухоли за счет механизмов иммуносупрессии [17] приводит к возникновению условий формирования эффекторов других клонов, в частности, в результате активации наивных Т-лимфоцитов [18–20]. Этим можно пояснить повышенное содержание CD45RА-клеток в опухоли у большинства обследованных больных, что, по-видимому, предопределяет благоприятное течение заболевания у пациентов с высоким содержанием CD8-клеток в паренхиме меланомы кожи.

В дополнение к полученным результатам можно привести описанные нами ранее [21] клинико-лабораторные критерии прогноза прогрессирования заболевания у больных первично-локализованной меланомой кожи, основанные на выявлении изменения показателей системного иммунитета при проведении адъювантной ИФН-терапии. По-нашему мнению, эти иммунологические критерии в сочетании с оценкой локального противоопухолевого иммунного ответа помогут определить индивидуальные особенности течения заболевания, прогнозировать реакцию организма на иммунотерапию и таким образом оптимизировать тактику лечения этой категории больных.

Дальнейшее развитие и усовершенствование этого подхода к прогнозированию течения заболевания у пациентов со злокачественными новообразованиями связано с гармонизацией в лабораторной диагностике. На этом пути важно преодолеть неизбежные сложности, ­обусловленные использованием в лабораториях разных реагентов, особенностями качественного и полуколичественного учета выраженности лимфоидно-клеточного инфильтрата, а также разными критериями выбора его локализации в ткани опухоли.

Разработка стандартного лабораторного протокола будет способствовать широкому внедрению иммунологических критериев в лабораторно-диагностический комплекс в онкологии.

Список использованной литературы

1. Lloyd O.C. (1969) Regression of malignant melanoma as a manifestation of a cellular immunity response. Proc. R. Soc. Med., 62: 543–545.

2. Cochran A.J. (1969) Histology and prognosis in malignant melanoma. J. Pathol., 97: 459–468.

3. Clemente C.G., Mihm M.C.J., Bufalino R. et al. (1996) Prognostic value of tumor infiltrating lymphocytes in the vertical growth phase of primary cutaneous melanoma. Cancer, 77: 1303–1310.

4. Bindea G., Mlecnik B., Fridman W.H. et al. (2011) The prognostic impact of anti-cancer immune response: a novel classification of cancer patients. Semin. Immunopathol., 33: 335–340.

5. Marincola F.M., Wang E., Herlyn M. et al. (2003) Tumors as elusive targets of T cell-based active immunotherapy. Trends Immunol., 24: 335–342.

6. Wang E., Miller L.D., Ohnmacht G.A. et al. (2002) Prospective molecular profiling of subcutaneous melanoma metastases suggests classifiers of immune responsiveness. Cancer Res., 62: 3581–3586.

7. Wang E., Panelli M.C., Zavaglia K. et al. (2004) Melanoma-restricted genes. J. Transl. Med., 2: 34–40.

8. Galon J., Costes A., Sanchez-Cabo F. et al. (2006) Type, density and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science, 313: 1960–1964.

9. Ascierto M.L., De Giorgi V., Liu Q. et al. (2011) An immunologic portrait of cancer. J. Translat. Med., 9: 146–159.

10. Harlin H., Meng Y., Peterson A.C. et al. (2009) Chemokine expression in melanoma metastases associated with CD8+ T-cell recruitment. Cancer Res., 69: 3077–3085.

11. Fox B.A., Schendel D.J., Butterfield L.H. et al. (2011) Defining the critical hundles in cancer immunotherapy. J. Translat. Med., 9: 214–253.

12. Bindea G., Mlecnik B., Fridman W.H. et al. (2010) Natural immunity to cancer in humans. Curr. Opin. Immunol., 22: 215–222.

13. Pages F., Galon J., Dieu-Nosjean M.C. et al. (2010) Immune infiltration in human tumors: a prognostic factor that should not be ignored. Oncogene, 29: 1093–1102.

14. Wolchok J.D., Hoos A., O’Day S.,et al. (2009) Guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors: immune-related response criteria. Clin. Cancer Res., 15(23): 7412–7420.

15. Mlecnik B., Bindea G., Pages F.et al. (2011) Tumor immunosurveillance in human cancers. Cancer Metastasis Rev., 30: 5–12.

16. Pages F., Kirilovsky A., Mlecnik B. et al. (2009) In situ cytotoxic and memory T cells predict outcome in patients with early-stage colorectal cancer. J. Clin. Oncol., 27: 5944–5951.

17. Wieërs G., Demotte N., Godelaine D. et al. (2011) Immune suppression in tumors as a surmountable obstacle to clinical efficacy of cancer vaccines. Cancers, 3: 2904–2954.

18. Lurquin C., Lethé B., Corbière V. et al. (2005) Contrasting frequencies of anti-tumor and anti-vaccine T cells in metastases of a melanoma patient vaccinated with a MAGE tumor antigen. J. Exp. Med., 201: 249–257.

19. Carrasco J., Van Pel A., Neyns B. et al. (2008) Vaccination of a melanoma patient with mature dendritic cells pulsed with MAGE-3 peptides triggers the activity of nonvaccine anti-tumor cells. J. Immunol., 180: 3585–3593.

20. Corbière V., Chapiro J., Stroobant V. et al. (2011) Antigen spreading contributes to MAGE vaccination-induced regression of melanoma metastases. Cancer Res., 71: 1253–1262.

21. Фільчаков Ф.В., Шуміліна К.С., Кукушкіна С.М. та ін. (2012) Імунологічні критерії прогнозу ефективності ад’ювантної інтерферонотерапії хворих на первинно-локалізовану меланому шкіри. Клин. онкол., 8(4): 120–125.

Адрес:
Фильчаков Феодосий Викторович
03022, Киев, ул. Ломоносова, 33/43
Национальный институт рака
Тел.: (044) 259-01-84
E-mail: labklimmun@i.ua

Коментарів немає » Додати свій

Leave a comment

Ім’я (required)

Mail (will not be published) (required)

Сайт

CAPTCHA Code